透明颤菌血红蛋白基因整合型大肠杆菌的培养特性研究.pdfVIP

透明颤菌血红蛋白基因整合型大肠杆菌的培养特性 陈新爱 徐志南 岑沛霖 (浙江大学材料与化学工程学院生物工程系，浙江，杭州，310027 摘要 透明级菌血红蛋白(VHb)是一种氧调节、氧结合蛋白，其基因vgb的表达在转录水平上受筑 调拉。本文研究了vgb整合型大肠杆菌E.mliBV的生长特性，不同价态的铁离子对其生长及VHb合 成的影响。研究表明0.2.M的二价铁离子具有促进VHb表达从而刹漱苗体细胞生长的作用。0.1- 低通气童条件下，E.coliBV的间歌发酵和流加发酵培养表明，由于VHb的大圣合成改善了细胞内氧 的传递，使生长期分别延长s，925小时和45小时，生物童 (DCW)分别达9.6@1L和26g/Lo 关锐词 进明翻菌血红蛋白，整合型大肠杆苗奋.cohB司 义 1 引盲 透明颇菌 (Vitreoscillasp.)是Beggiatoa家族的一种专性好氧的丝状革兰氏阴性菌，常年生长 在沼泽或腐叶等贫氧环境中。70年代末Tyree和WebmerlI等发现透明颇菌在贫氧环境下能诱导合 成一种可溶性的血红蛋白，从而具有专性好氧的特性。进一步研究表明，该蛋白质是原核生物 中仅有的一种血红蛋白类的蛋白质，由两个相同的亚基组成，每个亚基分子量均为15,775Da, 每分子含有两个b型血红素 (bHaem)，与真核生物的血红蛋白具有相当高的同源性和相似性， 被命名为透明颇菌血红蛋白(Vitreoscillahaemoglobin,VHb)IloVHb的生物合成与VitreosciUa的 生长条件关系密切，当溶氧成为生长限制性因素时，VHb的大量合成有利于微生物在贫氧环境 下的生长，VHb的这一特性在高耗氧的生物过程中具有重大的潜在应用价值。 应用基因工程技术，Vgb基因已经在多种微生物和植物中得到克隆和表达，并能使宿主菌更 好地在贫氧条件下生长和增加目标产物的生物合成，如在利用大肠杆菌IS-6」和醉母菌生产a-淀 粉igl6-al,欧文氏菌生产维生素CI0I,Acremoniumchrysogena.生产头抱菌素CICol等过程中，外源 VHb的表达可明显地增加目的产物的产量。近二十年来，由于基因工程技术的快速发展，重组 微生物的培养面临许多新挑战，如质粒稳定性，高密度培养等，其中很多涉及氧传递问题。尽 管已有不少大肠杆菌表达VHb的报道，但大多在质粒中克隆了vgb基因，VHb的表达和发挥作 用具有系统的特异性。本实验室通过基因同源重组技术，在常用的基因工程宿主菌E.coliBL21 的染色体上整合了vgb基因，获得了vgb整合型宿主菌— 大肠杆菌E.coliBV。本文拟研究该代 谢工程改造过的基因工程常用宿主菌E.coliBV的VHb表达和发酵特性，以期将其发展成为一个 具有发酵新特性的基因工程宿主菌，从根本上解决重组发酵的氧传递问题。 2 材料与方法 2.1 菌株 E.coliBL21(DE3),E.coliBV(vgb基因整合菌) 2.2 分析方法 葡萄糖浓度:离线测定葡萄浓度，发酵液于5000rpm离心l0min，采用DNS法测定上清液 中的葡萄糖浓度。 菌体密度:将培养液稀释到适宜浓度，用721型分光光度计测定OD，值。 细胞干重:取lOml发酵液，5000rpm离心15min，用等体积去离子水洗涤，离心，8090烘干 至恒重 ， SDS一PAGE:采用12%丙烯酞胺1甲叉双丙烯酞胺凝胶，以恒压法进行电泳。 6 VHb相对百分含量:采用PharmaciaVDS系统对SDS一PAGE胶进行灰度扫描积分。 菌体可溶性总蛋白:将培养液于5000rpm离心1Omin,弃上清，非变性条件下用50mm NaH,PO,(pH8.0),300.MNaCl裂解菌体，加人溶菌酶至1mg/mL，冰浴30min，用带有探头的细胞 超声粉碎仪进行细胞破碎，49C,10000rpm离心20-30min，采用Bradford法[X21测定可溶性总蛋白。 2.3 培养基 种子培养基 (g/L):蛋白陈10,酵母粉5,NaCl10,KH,P0,3,K,HP0,11pH7.0 发酵培养基:葡萄糖5g/L, (NH4)2SO,0.4g/L,NaCl5g/L,MgSO,0.1mM,CaCl,0.005mM, pH7.0;微量元素盐溶液 (lml/L),8.3mMNa