简化免疫胶体金标记技术.docVIP

包埋后免疫胶体金标记技术 试剂 固定液：0.1M二钾砷酸鈉缓冲液pH7.4（4%多聚甲醛+0.1%戊二醛+4%蔗糖） 洗涤液：0.1M二钾砷酸鈉缓冲液pH7.4（4%蔗糖） 醛基灭活液：0.1M二钾砷酸鈉缓冲液pH7.4（4%蔗糖+0.1M甘氨酸） 脱水剂：甲醇（ddH2O稀释成30%，50%，70%，80%，90%，95%） 包埋剂：K4M (2.7g交联剂A+17.3单体B+0.1g引发剂C) 标记封闭液：0.01M磷酸盐缓冲液pH7.4(1%BSA+0.05%TritonX-100+0.05%Tween 20) 标记洗涤液：0.01M磷酸盐缓冲液pH7.4 抗体稀释液：0.01M磷酸盐缓冲液pH7.4(1%BSA+0.05%Tween 20) 染色液：醋酸铀（3-4g醋酸双氧铀+100ml50%甲醇）；柠檬酸铅pH12（1.33g硝酸铅+1.76g柠檬酸鈉+30mlddH2O） 2. 主要仪器：镍网（喷有方华膜和碳膜）、镊子、Parafilm、自制小环、冰箱（4℃至-35℃）、紫外聚合箱、培养皿、透射电镜、离子溅射仪、超薄切片机、恒温箱（28℃） 0.2二钾砷酸鈉缓冲液母液pH7.4： 0.4M 二钾砷酸鈉（21.4g二钾砷酸鈉/250mlddH2O） 0.2M盐酸（4.5ml/250mlddH2O） 50ml二钾砷酸鈉(0.4M)中加入8ml左右0.2M盐酸，调节pH至pH7.2-7.4,加入ddH2O至终体积为100ml，即为0.2二甲砷酸鈉缓冲液母液pH7.4 2.5%戊二醛母液pH7.4： 25%戊二醛10ml +0.2M二钾砷酸鈉缓冲液50ml，加入ddH2O至终体积为100ml，pH无需再调，现配现用 4%多聚甲醛pH7.4： a.16%多聚甲醛25ml+0.2M二钾砷酸鈉缓冲液50ml，加入ddH2O至终体积为100ml，pH无需再调，现配现用 b. 2g多聚甲醛粉末+40ml ddH2O,70℃加热至粉末完全溶解，加入1.07g二钾砷酸鈉，用0.2M盐酸调至pH7.4，加入ddH2O至终体积为50ml，现配现用 0. 1M磷酸盐缓冲液pH7.4：NaH2PO4?H2O1.8g+23.25gNa2HPO4?7H2O+NaCl 5.0g.加入ddH2O至终体积为1000ml K4M：2.7g交联剂A+17..3单体B至离心管中，充入氮气以使其充分混合，在加入0.1g引发剂C，继续充入氮气至其完全溶解，配置好的K4M包埋剂-20℃保存 3%醋酸铀： 3-4g醋酸双氧铀至100ml浓度为50%的甲醇中，静置过夜，过滤后4℃避光保存 1%柠檬酸铅： 1.33g硝酸铅+1.76g柠檬酸鈉至30mlddH2O中，剧烈混匀，加入8ml1MNaOH至溶液变得澄清，加入ddH2O至终体积为50ml，最终pH12左右 3. 步骤及方法 3.1 取材与固定 对于培养与分离的细胞，随用随取，取材时越快越好，动物组织取材的最理想的方法是经过组织灌流固定后再用锋利的刀片将其切成1mm3以下大小的组织块，投入到固定液中继续固定。植物材料由于有较大的细胞间隙和通气组织，因此固定液较难渗透至里层细胞，需要抽气以利于固定液的渗透。考虑到渗透压及细胞的生理条件，固定液中蔗糖浓度为4%，pH值为7.4。固定后的样品脱水前需要用0.01MPBS清洗干净，然后再用含有甘氨酸的PBS漂洗，灭活自由醛基。 注意事项：a 固定液的选择直接决定了样品的结构和抗原性的保存，戊二醛浓度超过0.1%，抗原性会迅速减弱。一般固定条件选择多聚甲醛3%+戊二醛0.1%-0.5%之间，4℃固定2-5小时。b 固定液保存时间久后，醛基会氧化，降低固定能力，因此最好现配现用。c 固定液有害环境，可以使用奶粉等蛋白类制剂处理。 3.2 脱水 脱水是指将生物样品中含有的游离水逐步替换成有机溶剂的过程，其对样品的最大影响是对脂类的抽提并引起组织细胞的收缩。常用的脱水剂是甲醇、乙醇和丙酮。考虑到样品的抗原性及脱水剂对脂类物质的抽提，低温包埋制样时，样品的脱水在低温下进行。 注意事项：a 低温时，低浓度的甲醇和乙醇会形成冰晶，所以30%甲醇或乙醇脱水时在0℃进行，当脱水剂浓度超过50%时，样品移至-20℃至-35℃进行。b 甲醇分子量较小，在细胞间穿梭较快，可以缩短脱水时间，梯度脱水时间在15min即可，乙醇也可以达到很好的脱水效果，脱水时间延长至60min。 3.3 渗透和包埋 渗透是包埋剂逐步取代样品中脱水剂的过程。低温包埋的样品渗透是用脱水剂和包埋剂以1:1、1:2、1:3的比例低温（-20℃--35℃）梯度渗透，然后再用纯的包埋剂低温过夜渗透，最后置于新管包埋。 注意事项：a低温包埋时，使用透光性较好地包埋