草坪草普通狗牙根成熟胚组织培养再生体系的创建及基因枪法遗传转化体系的建立研究.pdfVIP

摘 要 草坪在现代生活中起着越来越重要的作用，以至己形成一项方兴未艾的产业— 草 坪业，对于草坪草的研究也逐渐形成了一门专门的学科— 草坪学。草坪学的研究与发 展离不开现代生物技术的发展和应用。由于传统育种手段的局限性，运用先进的分子生 物学手段— 植物遗传转化即转基因技术进行草坪草分子育种，培育理想的新品种，己 成为草坪草育种研究的必然趋势。狗牙根是最重要、应用最广泛的暖季型草坪草之一， 具备优良草坪草的诸多优点，但其抗寒性差、绿色期短、易感病等缺点极大地限制了它 更广泛的应用，在高尔夫球场等运动休闲场地的应用上，矮化也是其巫待解决的问题之 一。以目前技术而言，体外组织培养技术是草坪草转基因技术的基础。而狗牙根的组织 培养再生非常困难，主要是因其胚性愈伤组织的诱导和分化及其胚性细胞再生能力的保 持很困难，至今少有成功报道，这成为其遗传转化研究的瓶颈。 本文以普通狗牙根 (Cynodondactylon(L.)Pers.cv.`suncity)成熟颖果 (成熟胚) 为外植体，探讨了狗牙根胚性愈伤组织的诱导及分化条件，创建了一个操作简便、稳定 有效的普通狗牙根组织培养再生体系。结果表明:用颖果 (成熟胚)作外植体，以MS 为基本培养基，phytagel5g/L,2,4-D浓度在2.0mg/L-6.0mg/L之间，都能诱导出高频 率的胚性愈伤组织，而以2,4-D4.0mg/L为最佳，诱导率达88.5%0。不同继代及分化途 径对最终分化成苗的影响有显著差异。以在分化前由MS+2,4-D4.0m叭转移到MS+2, 4一2.0mgfL及112MS十2,4一2.0mg/L中继代，然后无激素的112MS中光照培养10天， 最后MS+6-BA3.0rng/L分化为最佳继代、分化途径，分化率31.7010。环境扫描电镜、 透射电镜观察到胚性愈伤组织与非胚性愈伤组织之间形态、结构上的差异，首次在细胞 学水平上描述了狗牙根愈伤组织胚性细胞的超微结构特点，证实了再生小苗是从体细胞 胚分化而来。 在建立起组织培养再生体系的基础上，利用BiolisticPDS-1000/He基因枪轰击胚性 愈伤组织，导入BIN2和PSAG12-IPT两个外源基因，成功获得大量再生植株。PCR,Northem blot分子检测表明，外源基因已整合入普通狗牙根基因组内，并获得表达。初步表型分 析亦显示外源基因在转基因植株中有所表达。从而证明基因枪法可用于狗牙根的遗传转 化研究，成功建立起狗牙根遗传转化体系。基因枪轰击法是一种操作简便、无宿主限制 的应用广泛的遗传转化方法，本文基因枪轰击参数为氦气压力1100psi，真空度27Torr, 射程9cm，金粉直径1.0pun，每平皿轰击两次。这是首次以成熟胚为外植体诱导胚性愈 伤组织，以基因枪转化，成功获得转基因普通狗牙根植株。 本文所建立的以成熟颖果 (成熟胚)为外植体，以基因枪轰击法直接导入外源基因 的普通狗牙根遗传转化系统简便易行，容易获得大量再生植株，而且周期短，外植体来 源丰富，可随时进行研究工作 为大量、深入开展狗牙根以及类似的暖季型草坪草生物 技术研究工作探索了一条便利 可行的道路。 关键词:草坪草 普通狗牙根 成熟胚 胚性愈伤组织 组织培养再生体系 基因枪 轰击法 遗传转化体系 ABSTRACT Turf-grassesplaymoreandmoreimportantrolesinourmodernlivesandtherearemore andmorepeopleandcompaniesrunintothefieldofresearchingonthem.Asthelimitsof traditionalmethod,usingmodern,advancedbiotechnologytoimproveturf-grassesis becominganunavoidabletrend.Burmudagrassisoneofthemostimportantworm-season turf-grassesandwidelyusedinthetemperateandtropicalregionsoftheworld.Asformost plantspecies,improvementofbermudagrassviabiotechnologydependsonimprovedtissue culture