PTEN在血管重建早期的作用.pptVIP

Role of the Phosphatase PTEN in Early Vascular Remodeling 磷酸酶PTEN在早期血管重建中的作用 发表日期：2013年4月 杂志：PLOS ONE IF：3.534 研究背景及目的 磷酸酶PTEN是PI3K（磷脂酰肌醇-3-羟激酶）蛋白激酶B（Akt）信号通路的一种重要的生理学抑制剂，在过去的研究中，我们致力于研究在体内和体外情况下PTEN在血管急性损伤后VSMC凋亡方面的作用。然而，PTEN在血管成形术诱导的血管损伤的早期阶段的作用尚不明了。 为了明确该作用机制，我们设计该实验以探究磷酸酶PTEN在早期血管重塑中的作用。 技术路线 1.体内(颈动脉损伤模型构建) 2.体外： 成年Wistar大鼠（300g) 颈总动脉分离 未处理（对照） 球囊损伤 12h后 PTEN表达量检测 取材（HcASMC） 细胞培养至第六代 干预 24h 转染 共转染PTEN/活化 的Akt突变体 血清 不同生长因子 周期性拉伸装置 H2O2 WT-PTEN质粒 SiRNA 敲出PTEN基因 凋亡VSMC数量 检测、Akt磷酸化 检测 VSMC凋亡数量检测 3.汇总数据、统计分析、得出结论 PTEN表达量检测 实验结果报告：图1A-D 为了探究血管受损后PTEN的表达及细胞凋亡情况，研究人员对实验大鼠颈动脉进行球囊损伤，12小时后，免疫组化检测各项指标如上图： PTEN (green), apoptotic smooth muscle cells (TUNEL staining,red) and nuclei (DAPI, blue） 由图可知：球扩后损伤较严重的区域PTEN表达量较多，正常细胞数量少、凋亡细胞数量密集（图上半部分） 实验结果报告：图1E-F western blot：using a specific PTEN antibody 微管蛋白 不同时间点PTEN相对表达量 densitometric analysis of immunoblots 对经/未经球扩后的标本裂解后通过免疫 沉淀反应进行PTEN活性检测： Immunoprecipitations employing an IgG iso-antibody and without addition of any antibodies served as controls 由图可知：在大鼠颈动脉受损后12H内，PTEN的表达具有时间依赖性（递增） 与对照组相比，其活性明显高于未受损的大鼠颈动脉标本。 时间依赖性？ 实验结果报告：图2A-E A:Lysates of cells exposed to mechanical forces using a stretching devicewere analyzed by western blotting using specific antibodies； B:Lysates of SMC exposed to growth medium (FCS). Cdk4（周期素依赖性激酶） served as loading control. C:Lysates of SMC exposed to oxidative stress using 500 mM H2O2. p53 and Cdk4 served as apoptotic marker and loading control, respectively. D：PTEN相对表达量的检测： quantified by densitometric analysis of immunoblots E：PTEN的活性检测： phosphatase activity assay of immunoprecip- itated protein from lysatesof HcASMC 注：PTEN（抗PTEN抗体） Bpv(一种PTEN的特异性抑制剂) 由图可知：PTEN受H2O2的氧化应激刺激后表达 显著增加，且上调的PTEN活性可被Bpv抑制。 为了探究哪些因素可以诱导PTEN的表达设计如下实验： 实验结果报告：图3A-C A:HcASMC transfected with a plasmid carrying WT-PTEN or a control (empty) vector. PTEN protein-expression levels were determined