炉栗散对糖尿病难愈性创面影响的实验研究.docVIP

精品论文 参考文献 炉栗散对糖尿病难愈性创面影响的实验研究 董毅1 徐哲2 （1大连大学附属新华医院 辽宁大连 116021；2 辽宁省大连市中心医院 辽宁大连 116031） 【中图分类号】R259 【文献标识码】B 【文章编号】1672-5085（2010）34-0429-02 【摘要】 目的 观察炉栗散对糖尿病难愈性创面愈合的影响。 方法 建立家兔糖尿病缺血创面模型，随机分成两组，分别使用炉栗散和凡士林纱条外敷，观察3、7、14天创面组织成纤维细胞数量、血清TGF-beta;1水平变化和创面大小的变化。结果 在3、7、14天炉栗散组TGF-beta;1水平变化和成纤维细胞数量变化均与与对照组有显著性差异，7、14天创面大小变化与对照组有显著性差异（P＜0.05）。结论 炉栗散组方能有效促进创面的愈合，值得在临床推广使用。 【关键词】 创面 TGF-beta;1 成纤维细胞 糖尿病难愈性创面在临床中屡见不鲜，不但严重影响生活质量，甚至可以造成截肢等严重后果，目前对其治疗尚缺乏有效的方法。炉栗散是本人在经典方剂的基础上加减制备而成的外敷粉剂，在临床应用中能有效促进创面的愈合，通过本实验来证实其疗效，为临床应用提供理论依据。 1 材料与方法 1.1 实验动物 大耳白兔20只，由大连医科大学提供，体重2.5kgplusmn;100g，平静饲养一周后，依据随机表格法，分为2组，每组10只，即实验组和对照组。 1.2 实验药物 炉栗散组方：炉甘石、黄柏、煅石膏、片栗粉、冰片等。由辽宁中医药大学制剂室制备成超微粉剂。 1.3 主要实验试剂和实验仪器 0.1%盐酸氯胺酮（福建古田制药股份有限公司）；四氧嘧啶，试剂编号：2244-11-5，瑞士FULKA公司产品，（由太阳生物有限公司提供）；Caresens血糖仪，编号：CSPI5F01611；Caresens试纸，编号：GA13CC95C，韩国 i-SENS公司产品；转化生长因子多克隆抗体TGF-beta;1，二抗抗体，工作浓度1：200，均由太阳生物有限公司提供；手动打孔仪，大连泛邦公司产品；BX51/52系统显微镜，日本Olympus产品。SX-100计算机图像分析仪，美国IBM公司产品。 1.4 方法 1.4.1 实验动物 造模前均测定血糖和尿糖含量，超出正常剔除。于造模前一周按150mg/kg腹腔注射3%四氧嘧啶，一周后查血糖浓度大于11mmol/L以及尿糖为 +++ 至 ++++ 时认为糖尿病模型制作成功。同时结扎兔耳单侧中央动脉及头侧动脉总干造成缺血模型，使用活检打孔器在各组兔耳腹侧面中央制成直径1.8cm的圆形皮肤缺损创面，其中心位置距离耳尖4cm。刮除软骨膜，暴露软骨，双层油纱覆盖，双层X光片固定兔耳。创面均为单侧，每天生理盐水清洁创面后对照组外敷凡士林油纱条，炉栗散组外敷炉栗散纱条，范围以能够覆盖创面即可。正常饮食水每天检查血糖浓度，低于11mmol/L时补注四氧嘧啶，使血糖浓度控制在11-16mmol/L之间。 1.4.2 研究方法 分别于第3、7、14天取创面边缘组织，每次每只各两块，同时抽取耳缘静脉血1ml，处理及观察方法如下： ① 成纤维细胞观察方法 取一块组织置于4%多聚甲醛中固定，经水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等步骤后，制成组织切片，H-E染色，在40倍光镜下观察4个不同视野，并记数。 ② 创面大小观察方法 分别于取组织时候测量创面的大小（mm），并记录。 ③ TGF-beta;1血清浓度的观察 均采取双抗夹心ELISA法，将抽取的血液3000r/m离心，提取血清，至于-20℃冰箱中保存。抗兔TGF-beta;1单抗包被于酶标板上，兔血清中的TGF-beta;1会与单抗结合，加入生物素化的抗兔TGF-beta;1二抗，它将与结合在单抗上的兔TGF-beta;1结合而形成免疫复合物，未结合的将被洗去，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin将与二抗的生物素结合，多余的物质将被洗去，加入TMB染色。根据OD值查找出TGF-beta;1（EGF）的浓度。兔的TGF-beta;1（EGF）浓度与OD（450nm）成正比。 2 结果 各组不同阶段TGF-beta;1水平变化见表1，炉栗散组和对照组相比在3、7、14天TGF-beta;1水平变化有显著性差异；不同时期成纤维细胞数量变化见表2，炉栗散组和对照组相比在3、7、14天均有显著性差异