谷氨酰胺改善过氧化氢引起的猪肠上皮细胞氧化应激及机制的研讨.pdf

谷氨酰胺改善过氧化氢引起的猪肠上 皮细胞氧化应激及机制的研究 王军军1 李德发1 雷晓青1 王晓秋1 陈 芳1 伍国耀2 (1中国农业大学动物科技学院，北京100094； 2TexasAM Station University，College77843) 摘要本研究旨在建立猪肠上皮细胞系的氧化应激模型．并在此基础上研究谷氨酰胺减缓氧化应激的效 果殛其机制。在仔猪肠道上皮细胞系培养过程中，添加不同组合的过氧化氢(0和n25mM)和谷氨酰胺 (n 例以度单位细胞蛋白舍量，选择合适的处理奈件，通过差异蛋白表达系统分析不同处理间的袁迭蛋白差异。结 果表明．过氧化氢处理减少了细胞的数量、降低了胞内csH／GSsG的比倒。增加了单位细胞的蛋白含量，并且 使细胞桂质浓缩聚团；而添加谷氨酰胺对于改善以上四十方面有较为明显的效果。对不同过氧化氢与谷氨酰胺 组合处理48h的细胞差异蛋白表达分析发现：过氧化氢处理降低了细胞增殖相关蛋白MelllionylaITlin“peptidase2、 odulin等的表达量，而提高了细胞骨架蛋白I越Iin (m)等蛋白的表达。这些蛋白的表达变化反映了细胞的生长受限、胞膜氧化损伤以度核相关的氧化抵抗。谷氨 酰胺的希加增加了对蛋白夸成和胞内钙调节具有重要意jL的钙网蛋白和转录因子BTF3的表达，降低了谷氨酰胺 合成酶的表达以厦可能引发免疫应激的MHccla鹤Ⅱ的表达。本研究的结果对进一步认识体外和体内谷氨酰胺改 善肠道氧化应激的效果厦其机制提供了一定的理论基础。 关键词谷氧酰胺过氧化氢氧化应教肠上皮细胞蛋白质组学 早期断奶是国内外集约化养猪生产的关键技术，但该措施又往往诱发早期断奶综合征，使得仔猪 早期断奶管理成为制约规模化养猪发展的瓶颈问题。断奶后消化道结构和功能的巨大变化是诱发断奶 应激综合征的重要原因…。目前的研究认为：早期断奶仔猪肠道结构和功能的变化受多种因素的影 响，如肠道微生物”J、母乳氨基酸供应中断”J、日粮类型改变”J、断奶厌食”1、日粮中免疫成分刺 激MJl和氧化应激”’1等。谷氨酰胺能调节细胞内氧化还原状态、氧化应激、细胞增殖与凋亡”““o。 Wl-等”2o还发现在21日龄断奶仔猪的玉米一豆粕日粮中添加1％的谷氨酰胺，可以阻止空肠绒毛高 度的降低并改善小猪的生长性能。近年来，早期断奶仔猪小肠黏膜细胞的氧化还原状态及其添加谷氨 酰胺在减缓氧化应激中的作用已受到了初步的关注”1。我们认为：仔猪在早期断奶时，母乳中谷氨 酰胺供应的中断以及多种环境因素的影响，可能使肠道黏膜细胞氧化还原状态恶化，促使细胞状态由 生长增殖转为凋亡，导致小肠绒毛高度降低和隐窝增生。谷氨酰胺直接或间接地调节细胞氧化还原状 态和氧化应激反应，从而影响细胞活力、增殖、凋亡、移动和肠道形态，进而有效减缓和改善早期断 奶综合征。 为证实谷氨酰胺在减缓氧化应激中的作用及其机制，本研究以仔猪小肠上皮细胞系为材料，在体 外培养过程中通过添加过氧化氢人为创造氧化应激环境，观察添加谷氨酰胺对减缓氧化应激的作用， ·基盒项目：早期断奶仔猪小肠黏膜细胞氧化应激机制的蛋白质组学研究。 作者简介：壬军军(1976一)，男．博士，主要从事小肠功能蛋白质组学研究，E—n血：jb唰@h毗Ⅲ且iL啪。 ·459- 摧营养与饲料研究进展 并在此基础上，通过比较蛋白质组学方法分析整个过程中的蛋白质表达变化，为谷氨酰胺减缓氧化应 激及其机制提供理沧基础。 1材料与方法 1．1猪肠道上皮细胞系及其培养 清。培养条件为37℃，5％CO：培养箱。 1．2试验处理 GsH／CssG比例的变化，确定一个合适的处理条件，进一步通过比较蛋白质组学技术，探讨细胞在过 氧化氢诱导的氧化应激以及添加谷氩酰胺时对蛋白表达的影响。 1．3细胞计数及其形态学分析 通过常规的血球计数板对浓缩后的细胞进行计数，并通过显微镜观察细胞形态，拍照。 1．4 GSH／GssG分析 通过HPLc同时分析样品中的还原型和氧化型谷胱甘肽。具体方法参照”…。