超耐热酸性α淀粉酶基因的克隆及其在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达研究.pdf

超耐热酸性a一淀粉酶基因的克隆及其 在大肠杆菌和毕赤酵母中的表达 摘 要 淀粉是植物营养物质的一种贮存形式，是一种独特且易于获得的能量来 wli。淀粉水解酶对于大部分生物摄取外界物质至关重要，它广泛存在于动物、 植物、及微生物中。其中，。一淀粉酶己被广泛地研究与应用。 近年的研究发现，许多嗜热古菌也能产生淀粉水解酶，因其具有独特的热 稳定性，引起人们的广泛关注。来源于极端嗜热古菌一激烈热球菌 (ArchaebacteriumPvrococcusfuriosus)的胞外。一淀粉酶，不但具有优越的 耐热性，而且其活性完全不依赖于金属离子，因此具有极高的工业价值。 本实验以激烈热球菌的基因组为模板，通过 PCR方法扩增到理想大小的 DNA片段。分别将其与质粒PEf-21a(+)和pPIC9K连接.将正确构建的重组质粒 pET-Amy转化大肠杆菌BL-21细胞，在IPT(;诱导下，该基因在大肠杆菌中得到 了表达，SDS分析表达产生的蛋白大约为 52kD，表达产生的a一淀粉酶其 最适反应温度为85V，最适反应pH值为5.50 将构建的重组质粒pPIC9K-Amy进行了序列测定，测序结果表明.克隆到的 基因片段(不含信号肤编码区)为13056p。将正确构建的重组质粒转化毕赤酵母 GS115细胞，该基因在酵母细胞中也得到了表达。在酵母a-Factor及AOX1基 因启动子和终止信号的调控下，超耐热酸性a一淀粉酶在毕赤酵母中大量表达 并分泌到胞外。该酶的表达受甲醇的严格调控和诱导，随着诱导培养时间的增 加在培养基上清液中的单位体积酶活力相应上升，在诱导培养七天后酶活力达 到最大值。重组酵母表达产生的。一淀粉酶其最适反应温度为 90-1000C，最适 反应pH值为4.5-5.0。该酶具有非常好的温度稳定性，在85℃条件下热处理5 小时，仍具有80%以上的酶活力，在100℃条件下热处理5小时，仍具有60%以 上的酶活力。该酶的这些优点使其非常适于在工业生产上应用，具有重要的意 义。 关键词:激烈热球菌，超耐热酸性。一淀粉酶，pE丁一21a(+)质粒 pPIC9K质 粒，大肠杆菌BL-21，毕赤酵母 sion MolecularCloningandExpres ofExtremelyThermostableand Acid-stableAmylasegeneinE.cofandPichispastoris GuoJianqiang(BiochemistryandMolecularBiology) Directedby:Prof.JiaoQinghua A B S T R A C T Starchisauniqueandeasilyaccessiblesourceofenergy.Starchhydrolyzing enzymesareoftenfoundinanimal,plantandmicroorganism,AmongtheStarch hydrolyzingenzymes,Thea-amylasehasbeenresearchedandusedveryextensively. Inrecentresearch,itisreportedthatsomespeciesofhyperthermophilicarchaeon canutilizestarchasthesolecarbonandenergysource.Theinterestshownbythe scientificcommunityinhyperthermophilicarchaeonwas partlybecausethe thermostableenzymestheyproduce.TheamylaseexpressedbytheArchaebacterium pyrococcusfuriosusisveryusefulforindustry,becauseitisextremelythermostable anditsactivityisindependentofCat+. TheAmylasegenewasamplified byPCR using hypert