实验五：考马斯亮蓝测定蛋白质含量精选.pptVIP

实验三:考马斯亮蓝测定蛋白质含量 一.目的:掌握考马斯亮蓝G－250染色法测定蛋 白质的原理和操作. 二.原理 三.仪器与用具 四.实验试剂 五.实验操作 六 实验报告 二.原理: 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。 该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 三.仪器与用具 721分光光度计；10 mL量筒1个；研钵；烧杯；量瓶；移液管：1 mL 3支，01 mL 3支；10 mL具塞刻度试管14支。 四.实验试剂 标准蛋白质溶液：用牛血清白蛋白配成含蛋白质100μg／ mL的标准蛋白溶液; 考马斯亮蓝G－250溶液：称取100μg考马斯亮蓝G－250，溶于50 mL 90％乙醇中，加入85％的磷酸100 mL ，最后用蒸馏水定容到1000 mL ，贮放在棕色瓶中，此溶液在常温下可放置1个月。 五.实验操作 1.标准曲线(蛋白质含量为0～100μg／ mL)的绘制　 牛血清蛋白溶液:浓度为100 μ g／ mL,按照表格配制  混合数次，放置5Min后，用1CM光径比色杯在595nM下比色（用第1管调0）。以蛋白质浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标绘制标准曲线。 2.样品提取液中蛋白质浓度的测定 吸取样品提取液1.0 mL ，放入 试管中 ，加入5Ml考马斯亮蓝G－250溶液，充分混合，放置2Min后在595nM下比色，记录吸光值，并通过标准曲线查得蛋白质含量。 注意事项: 1）如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收，因为这段时间内颜色最稳定。 2）测定中，蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，但此复合物的吸附量可以忽略。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。 思考题 （1）试比较该法与其他几种常用蛋白质定量测定方法的有缺点。 * * 5 5 5 5 5 5 5 5 考马斯亮蓝液（ml） 100 80 60 40 20 0 蛋白质含量（μg） 0 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 蒸馏水（ml） 1 1 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 蛋白质标准液（ml） 样品2 样品1 6 5 4 3 2 1 管号