基于反相有机整体柱的新型蛋白质酶反应器研究.pdfVIP

第41卷 分析化学 (FENXIHUAXUE) 特约来稿 第 1期 2013年 1月 ChineseJournalofAnalyticalChemistry 10～14 DOI：10．3724／SP．J．1096．2013．20720 基于反相有机整体柱的新型蛋 白质酶反应器 刘 静 2 王方军 张振宾 2 邹汉法 (中国科学院大连化学物理研究所，中国科学院分离分析化学重点实验室，大连 116023) (中国科学院研究生院，北京 100049) 摘 要 以牛血清白蛋白(BSA)为标准样品，以鉴定的独立肽段数 目、蛋白质鉴定覆盖率和漏切率为考察指 标，通过考察酶解缓冲液、反相柱基质的多孔结构、酶解反应时问和整体柱的疏水性对反相蛋白质酶反应器酶 解效率的影响，构建了一个基于反相有机整体柱的新型酶反应器，此反应器具有制备简单、通透性好、酶解时 间短和蛋白质鉴定覆盖率高等特点。 关键词 反相有机整体柱；蛋白质酶反应器；液相色谱一质谱联用 1 引 言 随着电喷雾 (ESI)和基质辅助激光解析(MALDI)等软电离技术的出现及相关质谱技术的发展，生 物质谱已成为现代蛋 白质组学研究的核心技术。基于质谱技术的蛋 白质组学研究策略一般分为两种： 一 种是 自上而下Top．down策略，一种是 自下而上Bottom—up策略。由于现阶段质谱检测分子量范围和 蛋白质分子低溶解度、低离子化效率的限制，Bottom-up分析策略应用更为广泛。Bottom—up策略基于对 酶解肽段的鉴定实现对蛋 白质的鉴定，因此蛋 白质的酶解是该分析策略的关键步骤之一。常规溶液酶 解耗时长、操作繁琐、分析通量低，且后续的除盐步骤会造成严重的样品损失，不适于微量复杂蛋白质样 品的分析。蛋 白质酶反应器是用于蛋白质样品预处理及酶解的微流器件，主要分为固定化酶反应器和 吸附型酶反应器两种 。前者将蛋 白酶固载在固相基质上，蛋 白质在通过固相基质的过程 中完成酶 解；后者将蛋 白质样品和蛋白酶通过离子交换等作用吸附在固相基质上面，通过调节pH值活化蛋 白质 酶进行酶解。蛋 白质酶反应器可实现蛋 白质除盐纯化、修饰蛋 白质富集等样品预处理与蛋 白质酶解的 集成，减少分析过程中的蛋 白质样品损失，从而提高分析通量和检测灵敏度 。 整体柱因其制备简单、通透性好、传质速度快等优点，在蛋 白质酶反应器中被广泛应用。甲基丙烯 酸缩水甘油酯一二甲基丙烯酸乙二酯 (GMA．EDMA)有机聚合物整体柱和有机-无机杂化整体柱材料都 被用作蛋 白酶的固载基质，实现了蛋 白质样品的快速、高效酶解8『1。但是固定化酶反应器的酶固载反 应耗时长、操作繁琐且固定化过程易影响酶活性 。吸附型酶反应器无需酶固载步骤，操作简单，更容易 实现多次重复使用。Tian等[1伽发展了磺酸基强阳离子交换整体柱吸附型胰蛋 白酶反应器，对干细胞样 品进行了大规模、高灵敏度和高准确度的定量蛋白质组分析。 现有的吸附型酶反应器一般基于强阳离子和强阴离子交换色谱基质，尚无基于反相色谱基质的吸 附型酶反应器的研究报道。这主要是由于反相色谱基质对蛋 白质和蛋 白酶的吸附作用较强，无法通过 调节pH值使蛋 白质样品和酶游离并充分接触，从而限制了酶解效率地提高。Russell等 Ⅵ报道了胰蛋 白酶等多种蛋白酶在80％乙腈中具有更高的酶解效率，可以显著缩短酶解时间并提高蛋白质鉴定的覆 盖率。本研究制备了基于反相有机整体柱的吸附型蛋 白质酶反应器，在完成蛋 白质样品和酶吸附后通 过高浓度乙腈实现样品和酶的游离，从而提高酶解效率。本研究将反相整体柱应用于吸附型蛋白质酶 反应器的制备，制备的新型蛋白质酶反应器既具备了整体柱通透性好、传质速度快的优点，又具备高有 机相中酶解速度快、蛋白质鉴定覆盖率高的优势，在蛋白质组分析中具有 良好的应用前景。 2012-07—10收稿；2012—10—12接受 本文系中国科学院科研装备研制项 目(No．P020090520)和国家 自然科学基金创新群体项 目(No2．1021004)资助 E—mail：hanfazou@diep．ac．cn；wangtj@di