医学细胞生物学设计型实验.pptx

医学细胞生物学设计型实验 动物细胞融合 实验目的 1、了解动物细胞融合的常用方法。 2、学习化学融合的基本操作过程。 3、观察动物细胞融和过程中细胞的行为和变化。 实验用品 显微镜、水浴箱、普通离心机、高心管、载玻片、盖玻片、酒精灯、试管、量筒、电子天枰 肝素钠、Alsever液、0.85%生理盐水、Hanks液、聚乙二醇（PEG Mr=4000） 0.2%亚甲基蓝染液 实验原理 细胞融合（cell fusion）：由两个或多个细胞相互接触后，其细胞膜发生分子重排，导致细胞合并、染色体等遗传物质重组的过程称为细胞融合。分为细胞自发融合和诱导细胞融合。 诱导细胞融合（ induced cell fusion） 诱导细胞融合的方法主要有用灭活的仙台病毒、聚乙二醇和电脉冲法。 细胞自发融合 指在未施加任何条件的情况下所发生的细胞融合现象。 实验步骤——细胞融合 1、取10%的鸡血细胞悬液1ml放入离心管中，加入5ml Hanks液混匀，1000r\min 离心5min，小心弃上清液；加入8—10ml Hanks液再次悬浮细胞，离心洗涤一次，弃上清液后将离心管倒置于滤纸上，尽量流尽残余液体。用手指轻弹离心管底壁，使细胞团松散。 2、取50%PEG 0.5ml，在1min内逐滴加入到离心管中，边加边轻轻摇动混匀，将PEG全部加入后静止1—2min（此过程要在37℃的水浴中进行） 实验步骤——细胞融合 3、缓慢加入9ml Hanks液，轻轻吹打混匀，在37℃水浴中静止5min。 4、离心弃上清液，加入2—3ml Hanks液，在37℃水浴中温育20—30min。 实验步骤——制片及观察 分别温育5min、10min、20min、30min后，取细胞悬液一滴制成临时装片，以0.2%亚甲基蓝染液染色，在显微镜下观察细胞融合的不同阶段 实验步骤——制片及观察 通常将融合过程分为5个阶段： 1、两个细胞的细胞膜互相接触、黏连。 2、相接的两细胞膜破口粘合形成细胞膜通道。 3、两细胞之间细胞质相遇，形成细胞质通道。 4、通道扩大，两细胞连成一体。 5、细胞合并完成，形成一个含有两个或多个核的圆形细胞。 实验步骤——融合率 融合率是指在显微镜视野内，已发生融合的细胞，其细胞核总数与视野内所有细胞（包括已融合和未融合细胞）的细胞核总数之比。对孵育30min时制备的临时装片计算融合率。通常以百分数表示，进行多个视野测定值的平均统计更加准确。 融合率=（融合的细胞核数 /总细胞核数）×100% 注意事项 1、制备的50%PEG一定要保存于37℃水浴中，不然冷却后结晶析出。 2、在理想管中加PEG之前，一定要将离心管倒置于滤纸上，流尽剩余液体，否则残留液会改变PEG的浓度。 3.操作规范，防止试剂污染。 4.细胞悬液的涂片制作要轻柔。 5.使用离心机要注意平衡，转速从低到高。 完 谢谢！ 离心洗涤 洗涤的目的是洗去固体中的残留溶剂，保证固体中尽量少的杂质残留；具体操作就是离心过程中，无明显液体被离心机甩出后，降低离心机的转速，保持离心机中速转动下，向离心机转鼓内加入洗涤所需溶剂，利用离心机旋转产生的向心力使液体均匀分布于离心袋内的固体上，再开启离心机，甩出其中的液体。