甜菜碱对痫性放电的离体海马神经元线粒体膜电位的影响.docVIP

精品论文 参考文献 甜菜碱对痫性放电的离体海马神经元线粒体膜电位的影响 杜彦辉 刘君星*（黑龙江佳木斯大学基础医学院 154007） 　　【摘要】目的：观察无镁离子诱导的离体培养海马神经元异常放电时线粒体膜电位变化及甜菜碱的干预作用，初步探讨甜菜碱抑制癫痫可能的作用机制。方法：分离培养Wistar 大鼠海马神经元细胞，将海马神经元全液换成无镁细胞液处理3h 造成痫性放电模型，以浓度为100mu;mol/ L 甜菜碱进行干预，以100mu;mol/ L 的gamma;- 氨基丁酸、100mg/L 的丙戊酸钠作为对照，各组处理完然后恢复正常培养12h、24h、48h、72 后取材。MTT 法检测细胞存活率，流式细胞仪检测线粒体膜电位并分析细胞凋亡情况。结果：模型组海马线粒体膜电位明显下降( Plt; 0.01)，凋亡发生率增加( Plt; 0.01)，甜菜碱治疗组与模型组相比，海马线粒体膜电位下降( Plt; 0.01)。凋亡发生率增加( Plt; 0. 01)。结论: 甜菜碱稳定线粒体膜电位的作用较弱，没有降低细胞凋亡率。结论：在离体实验中甜菜碱对痫性放电的海马神经元微弱的保护作用，推测其作用机制可能并不是影响海马神经元的线粒体膜电位。 　　【关键词】甜菜碱；线粒体膜电位；细胞凋亡；癫痫【中图分类号】 R2 【文献标号】 A 【文章编号】 2095-7165（2015）09-0000-02 　　癫痫（epilepsy,EP）是一种常见的慢性脑部疾病，是神经元间歇性异常放电的结果，此类患者绝大多数需要长期乃至终生服用抗癫痫药物(Anti-epileptic drugs，AEDs)。目前，关于癫痫病理机制的研究和药物开发尽管有了长足的发展; 但仍有1/3 的癫痫病人为难治性癫痫，需要长期依靠药物来维持，且存在着严重的副作用，中药以其疗效稳定、无明显毒副作用等优势，对癫痫的治疗取得较大进展, 中医药治疗癫痫已有数千年历史，积累了丰富经验，大量的动物实验已证实甜菜碱具有抑制癫痫发作的作用，而本实验研究目的是从神经元方面研究甜菜碱的抗癫痫机制，本实验通过测定灵芝生物碱- 甜菜碱对离体海马神经元线粒体膜电位及细胞凋亡的影响。探讨灵芝生物碱- 甜菜碱对海马神经元异常放电致损伤的保护作用及机制。从而为探讨甜菜碱的药理机制提供依据。 　　1 材料与方法1.1 主要材料1.1.1 动物与试剂24h 内新生清洁级Wistar 大鼠，雌雄不限，体重4.5g-6.0g，购自佳木斯大学实验动物中心。Neurobasal 培养液，Gibco 公司；L-谷氨酰胺，Gibco 公司；B-27，Gibco 公司；特级胎牛血清，Gibco公司；胰蛋白酶，Gibco 公司；线粒体膜电位检测试剂盒，南京凯基生物科技发展有限公司。 　　1.1.2 仪器-80 ℃ 冰箱，Thermo 公司； 流式细胞仪，FACS CaliburBecton-Dickinson；酶联免疫检测仪，BioTek 公司。 　　1.2 方法1.2.1 模型制备和实验分组：我们采用24h 内新生Wistar 大鼠为细胞源，用Neurobasal 培养液培养海马神经元，分离的海马神经元置96 孔细胞培养板内，每孔加0.2ml 含1times;105 个/ml 分离好的大鼠海马神经元细胞悬液，在37℃ 5％ CO2 培养。培养9d 后，实验分组为正常对照组：换正常细胞外液处理3h，然后恢复正常培养24h；无Mg2+ 诱导组、甜菜碱组、gamma;- 氨基丁酸组、丙戊酸钠组分别换成无镁细胞外液或添加相应的100mu;mol/ L 甜菜碱、100mu;mol/ L 的gamma;- 氨基丁酸、100mg/L 的丙戊酸钠混悬液处理3h，然后恢复正常培养，分别在处理后的12h、24h、48h、72h 进行MTT 检测，观察甜菜碱对大鼠海马神经元癫痫样细胞的保护作用。流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的变化。 　　1.2.2 MTT 法检测各组海马神经元细胞存活率取各组待测细胞MTT 染色，490nm 波长下检测吸光度值。 　　1.2.3 JC-1 染色法检测线粒体膜电位培养至第9d 的海马神经元，全液更换成无镁细胞外液处理3h之后，实验分组如上，继续培养24h，收集细胞，JC-1 染色（按试剂盒要求操作），流式细胞仪检测线粒体膜电位，记录激发波长488nm 处红色荧光。 　　1.3 统计学处理采用SPSS18.0 的统计软件进行数据处理，计量资料以均数plusmn; 标准差（ ）表示，采用t 检验，计数资料采用chi;2 检验，Plt;0.05 表示差异具有统计学意义。 　　2 实验结果：2.1 MTT 检测结果 　　注：* 与正常组比较 Plt;0.01由表所示：模型组细胞凋亡率31.88% 较正常组28.84%