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实验目的：
1. 了解基因工程的基本概念，掌握基因工程的基本条件，熟记基因工程的操作过程。
2. 掌握重组DNA技术所需的基本条件，如用于核酸操作的工具酶，用于基因克隆的载体以及用于基因转移的受体菌或细胞等。
3. 了解并掌握重组子的筛选方法及原理。
4. 掌握质粒的提取方法和琼脂糖凝胶电泳回收核酸的方法。
5. 掌握PCR技术的操作原理及PCR程序的编写。
6. 复习并巩固微生物实验中的无菌操作技术。
二．实验原理：
1. 基因工程的概念：利用DNA体外重组或PCR扩增技术从某种生物基因组中分离感兴趣的基因，或是用人工合成的方法获取基因，然后经过一系列切割，加工修饰，连接反应形成重组DNA分子，再将其转入适当的受体细胞，以期获得基因表达的过程.
2. 基因工程的主要内容：
2.1 从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段。
2.2 在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分子上，形成重组DNA分子。
2.3 将重组DNA分子转移到适当的受体细胞(亦称寄主细胞)，并与之一起增殖。
2.4 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的受体细胞克隆。
2.5 功能表达，产生出人类所需要的物质。
3. 基因工程中的工具酶：
3.1限制性内切酶——主要用于DNA分子的特异切割
3.11 限制性内切酶主要可分为Ⅰ型，Ⅱ型，Ⅲ型；其中Ⅱ型的限制性内切酶主要是别DNA分子4—8对碱基的特定序列，大部分酶的切割位点在识别序列内部活两侧，识别切割序列呈典型的旋转对称结构，也称回文结构。
3.12 其中1U核酸内切酶的活性定义为：在最佳反应条件下反应一小时，完全水解1ug标注DNA所需的酶量。
3.13 影响限制性内切酶活性的因素:DNA样品的纯度如其中掺杂了蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、
EDTA、SDS、NaCl等均会影响限制性核酸酶的活性。可通过加大酶的用量，加大反应总体积，延长反应时间等来解决。
3.2 核酸连接酶——用于DNA和RNA的连接：
3.21 核算连接酶1U的定义为：在最佳反应条件下，15°C反应1小时，完全连接1ugDNA所需的酶量。
3.22 平头双链DNA片段的连接操作：从分子动力学的角度讲，有限制性内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。可以通过加大连接酶的用量，加大平头末端底物的浓度，加入10%PEG8000，从而促进大分子间的有效作用，也可以通过加入单价阳离子来提高平头末端的连接效率；
3.3 核酸酶——用于DNA和RNA的非特异性切割
3.4 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成
3.41. 核酸聚合酶的特点：分离自水生栖热菌，分子量为94,000，最适反应温度75℃， 对95℃高温具良好稳定性，该酶不存在3’→5’外切酶活性
3.42. 核酸聚合酶的用途：主要用于DNA的体外扩增，经25次循环后才进入酶的反应稳定期，一个DNA 分子因而可被扩增4×106倍。
3.43. DNA扩增技术又称为聚合酶链式反应(PCR)，它包括DNA模板变性(95℃)→与DNA引物退火(45℃)→引物延伸（72℃)这三个步骤。
3.5 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰；其它酶类--用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。
用于基因克隆的载体：
4.1 用于基因克隆的载体功能及特性：
4.1.1载体的功能：a.运送外援基因高效率准入受体细胞；
b. 为外援基因提供复制能力活整合能力；
c. 为外援基因的扩增活表达提供必要的条件；
4.1.2 载体应具备的特性：a. 具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性（可转移性）；
b. 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合为点；
c. 具有较高的外援DNA的装载能力；
d. 具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点；
e. 具有合适的筛选标记；
4.2 质粒（plasmid）
4.2.1 质粒的一般生物学特性；
4.2.1.1 质粒DNA：质粒是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的DNA分子。
4.2.1.2 编码抗菌素抗性基因的质粒叫R质粒。R质粒可将其抗性转移到缺乏该质粒的适宜的受体细
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