分子生物学实验（吉林大学）重组人白介素-18 rhIL-18 基因工程菌的构建2.pptVIP

重组人白介素-18(rhIL-18)基因工程菌的构建 分子生物学实验-实验操作 基因、载体、受体菌株 实验技术要求 应掌握的实验技术 酶切,连接 凝胶回收 制备感受态细胞 质粒提取 PCR 琼脂糖凝胶电泳 考察指标 电泳、蓝白斑数量 电泳 感受态细胞转化率 电泳 电泳 电泳 实验流程: 第一天 8AM-5PM （重组载体构建） 实验流程: 第二天 8AM-5PM （重组载体转化宿主细胞） 实验流程: 第三天 1PM-5PM（阳性转化子鉴别及转化效率检验） 实验流程: 第四天 8AM-5PM（含有目的基因重组载体的鉴定） 实验流程: 第一天 8AM-5PM （重组载体构建） Hybrid site rhIL-18的PCR （1）反应体系 Template DNA 2.0ul 10×buffer 5.0ul MgCl2（25mmol/L） 6.0ul primer1（25umol/L） 1.0ul primer2（25umol/L） 1.0ul dNTP（2mmol/L） 4.0ul Taq酶（5u/uL） 1.0ul 灭菌超纯水 补齐至50ul 双酶切反应（20μL体系） rhIL-18的PCR产物 目的基因 6.8μL Buffer O 2μL 无菌水 9.2μL BSA(2mg/ml) 1.0μL BglⅡ 0.5μL PstⅠ 0.5μL 质粒pUC18 质粒(PUC-18) 10μL 10×BamHⅠBuffer 2μL 无菌水 6.4μL BamHⅠ(5u/ul) 0.6μL PstⅠ 1μL 培养基配制 LB液体培养基 每1L配量： 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠 5g 滴加5N NaOH（约0.2mL），调节pH值至7.0 LB固体培养基: 每100ml液体培养基添加1.5g琼脂 每组准备： 3个30ml 液体培养基 120ml 固体培养基 灭菌 5个培养皿 3个30ml LB 液体培养基 1个120ml LB 固体培养基 一个50ml 离心筒 微量移液器头(枪头)和EP管 琼脂糖电泳 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA 片段的标准方法。 DNA 的分子大小 琼脂糖浓度 DNA 分子的构象 电源电压 嵌入染料的存在 离子强度影响 琼脂糖凝胶制作图示 琼脂糖凝胶的配制 称取0.3g琼脂糖，加入30ml 1×TAE缓冲液，于微波炉中加热沸腾3次。 （基因染料） 将凝胶倒入调平的凝胶板上，插入梳子。 冷却。 琼脂糖凝胶回收 琼脂糖凝胶电泳检验，回收酶切产物：使用柱式凝胶回收试剂盒 分别对： 目的基因片段（0.5Kb片段）溶液回收 载体片段（2.7Kb片段）进行凝胶回收 琼脂糖凝胶回收 1.将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。 2.向胶块中加入3倍体积Buffer B2（如凝胶重为100mg，其体积可视为100μL，依此类推）。50℃水浴放置6–10min，间断(2-3min)温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可继续放置几分钟，直至胶块溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块）。（将目的基因体积补至100μL，由此补平行操作。） 注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。