分子生物学实验（吉林大学）重组人白介素-18基因工程菌的构建.docVIP

吉林大学国家级生物实验教学示范中心实验报告 课程名称：分子生物学实验 实验题目：重组人白介素-18基因工程菌的构建 年 月 日 姓名：李志远 学号 年级：2012级 专业：药物制剂 组别：4 一、实验目的 1、掌握酶切,连接、凝胶回收、制备感受态细胞、质粒提取、PCR、琼脂糖凝胶电泳的实验技术 2、掌握酶切,连接、凝胶回收、制备感受态细胞、质粒提取、PCR、琼脂糖凝胶电泳的实验原理 二、实验原理 白细胞介素18是近年来新发现的细胞因子；具有较强的免疫调节生物学活性；与肿瘤的发生发展密切相关；对多种肿瘤细胞显示出较强的抑瘤效应。 琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA 片段的标准方法。 氯化钙法是将处于对数生长期的细菌置于0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca离子使细胞膜磷脂层形成液晶结构，然后经42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加。 基因、载体、受体菌株 酶切连接 PCR 转化 质粒提取 实验用品 器材：PTC-100、电泳仪、超净台、Power Pac Basic TM、高速冷冻离心机MiniSpin、移液枪、innova4000、 药品：Template DNA10×buffer、MgCl2（25mmol/L）、primer1（25umol/L）、primer2（25umol/L） 、dNTP（2mmol/L）、Taq酶（5u/uL）、Buffer O 、无菌水、BSA(2mg/ml)、BglⅡ 、PstⅠ 材料：载体质粒pUC18、rhIL-18基因的PCR产物 实验步骤 （一）按照所给配方加入试剂 rhIL-18的PCR产物 质粒pUC18 目的基因 6.8μL 质粒(PUC-18) 10μL Buffer O 2μL 10×BamHⅠBuffer 2μL 无菌水 9.2μL 无菌水 6.4μL BSA(2mg/ml) 1.0μL BamHⅠ(5u/ul) 0.6μL BglⅡ 0.5μL PstⅠ 1μL PstⅠ 0.5μL 样品加完后做好标记37℃酶切反应3小时 吉林大学国家级生物实验教学示范中心实验报告 课程名称：分子生物学实验 实验题目：重组人白介素-18基因工程菌的构建 年 月 日 姓名：李志远 学号 年级：2012级 专业：药物制剂 组别：4 （二）配制培养基 LB液体培养基(每1L配量)： 蛋白胨 10g 酵母提取物 5g 氯化钠 5g 滴加5N NaOH（约0.2mL），调节pH值至7.0 LB固体培养基: 每100ml液体培养基添加1.5g琼脂 每组准备： 3个30ml 液体培养基 1个120ml 固体培养基 配制完将5个培养皿，3个30ml LB 液体培养基，1个120ml LB 固体培养基，一个50ml 离心筒，微量移液器头(枪头)和EP管进行灭菌。 琼脂糖电泳 琼脂糖凝胶的制备 称取0.3g琼脂糖，加入30ml 1×TAE缓冲液，于微波炉中加热沸腾3次。 将凝胶倒入调平的凝胶板上，插入梳子。冷却。 琼脂糖凝胶回收 琼脂糖凝胶电泳检验，回收酶切产物：使用柱式凝胶回收试剂盒 分别对： 目的基因片段（0.5Kb片段）溶液回收 载体片段（2.7Kb片段）进行凝胶回收 （1）将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。 （2）向胶块中加入3倍体积Buffer B2（如凝胶重为100mg，其