生化试验（吉林大学）三、实验步骤及原理.pptxVIP

1; 三、实验步骤及原理;生物材料破碎的方法;1. 酶的蛋白属性； 2. 调节酶溶解度的方法； 有机溶剂分级沉淀 3. 根据酶分子大小、形 状不同的分离方法； 透析、凝胶层析 4. 根据酶分子电荷性质 的分离方法； 离子交换层析 5. 根据酶分子专一性结 合的方法;;1. 酶的蛋白属性 两性电离 蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液 pH 条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。 等电点 (isoelectric point, pI) 当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的 pH 称为蛋白质的等电点。 胶体 分子量自1 万至100 万范围，分子直径可达 1～100nm，为胶体范围之内。 稳定的因素： 颗粒表面电荷 水化层; 有机溶剂分级沉淀操作条件的控制 溶剂选择 常用的溶剂是乙醇、丙酮、甲醇，二甲基甲酰胺（DMF）、二甲基亚砜（DMSO）也可做沉淀剂。沉淀用有机溶剂的选择主要应考虑沉淀作用强、对生物分子的变性作用小、毒性小以及挥发性适中。 温度 使用有机溶剂沉淀生物大分子时应控制在低温下进行。 样品浓度的控制 一般认为蛋白质的初始浓度为 0.5%-2% 为好。; 凝胶层析的基本原理 凝胶层析是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，其原理是分子筛效应，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。 在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。 凝胶层析的应用范围： 凝胶层析法适用于分离和提纯蛋白质、酶、多肽、激素、多糖、核酸类等物质。分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。利用凝胶的分子筛特性，可对这些物质的溶液进行脱盐、浓缩、去热源和脱色。 凝胶层析的特点 凝胶层析操作简便，所需设备简单； 分离效果较好，重复性高。最突出的是样品回收率高，接近100％； 分离条件缓和。凝胶骨架亲水，分离过程又不涉及化学键的变化，所以对分离物的活性没有不良影响； 应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化、脱盐、浓缩以及分析测定等。 分离的分子量范围很宽，如 Sephadex G类为102～105D；Sepharose类为105～108D。; 装柱：将玻璃柱固定垂直，装入蒸馏水（约为柱体积的 1/3），以避免胶粒直接冲击柱底支持物。固定玻璃柱，调整垂直； 装凝胶：边搅拌凝胶，边向柱内缓慢、连续、均匀地装入凝胶（打开柱底端的螺旋夹）不要中断，使胶粒均匀沉降，以免胶面倾斜和发生断层；;4. 根据酶分子电荷性质的分离方法；; 上样：将储液瓶中的缓冲液放尽，封闭出口，将E2 加入到储液瓶中，连接出口与离子交换柱的进液管道，打开截流阀，注意控制流速，使流出液的流出速度为1.5ml/min左右。 洗柱：样品全部进入床面后，在柱面加入2cm的缓冲液，在储液瓶中加入5mmol/L pH6.0的磷酸缓冲液，连接紫外检测器、记录仪和收集器，打开截流阀，洗出未吸附的杂蛋白。目测记录仪上的紫外吸收峰的酶活力，检查流出液中是否有酶活力存在（即酶是否结合在离子交换树脂上）。洗柱体积控制在5个柱体积左右。 目测酶活力方法：取两支试管，各加入1ml 5%蔗糖液，然后于一支中加入1ml起始缓冲液，另一支中加1ml洗柱流出液，同时于35℃恒温水浴中进行水解反应3min，然后各加DNS 试剂1ml ，于沸水浴中反应5min ，比较两支试管颜色的深浅。 洗脱：本实验用阶段洗脱进行。用含 0.15mol/L NaCl的5mmol/L pH6.0的磷酸缓冲液100ml，控制流速为1.5ml/min，用小试管收集。收集酶活力峰：目测记录仪上的蛋白峰的酶活力，确定酶活力峰的位置。 用试管收集峰尖处的样品3ml（交给老师），浓缩后用于凝胶层析；合并其它剩余酶活力峰得到E3，量出总体积V3（留2ml置于冰箱中保存，待测酶活力及蛋白质浓度），其它酶液于4℃过夜透析，留动力学实验使用。;酶的纯化方法;1、测定酶活力时应注意几点 ; 酶活力单位： 国际单位（IU）：在特定的条件下，每分钟催化1μmol 底物转化为产物所需的酶量。 催量单位（kat）：在特定条件下，每秒钟使1mol底物转化为产物所需的酶量。 1 IU= 16.67×10-9 kat; DNS 法测