突变质粒APPswe的构建.docVIP

精品论文 参考文献 突变质粒APPswe的构建 辽宁医学院附属第三医院 辽宁锦州 121000 摘要：目的：将质粒APP695进行1个突变体构建。方法：将第1785bp-1786bp（以目的基因ATG为起始）的碱基GA突变为TC，3端去掉终止密码子TAG，克隆至pEGFP-N2载体中。结果：构建了突变质粒APPswe。 关键词：阿尔茨海默病；APPswe；质粒 前言 淀粉样前体蛋白基因（amyloid precursor protein，APP）是阿尔茨海默病（AD）相关基因之一。此基因按其转录产物的剪接方式不同可以生成至少6种 APP的亚型，其中最主要的三种为 APP695、APP751、APP770。其中APP695蛋白主要在脑组织神经元中表达。beta;淀粉样蛋白（beta; amyloid protein，A beta;）是构成 AD主要病理学特征之一，来源于APP蛋白[1][2]。 APP基因某些位点的突变可以引发某些家族的早发性 AD，瑞典家系的突变 Swedish mutations（K595N/M596L）是 APP的 595 /596位点密码子双重突变，即两个碱基对发生改变（Lysrarr;Asn，Metrarr;Leu），使赖氨酸被天冬氨酸置换，蛋氨酸被亮氨酸替代，从而导致 APP 的代谢过程发生改变，造成 A beta;过度沉积〔3〕[4]. 实验方法： 一．引物设计与合成 序列（5rsquo;－3rsquo;） F01：CTCAAGCTTCGAATTCATGCTGCCCGGTTTGGCAC F02：TCTGAAGTGAATCTGGATGCAGAATTCCGAC R01：GCATCCAGATTCACTTCAGAGATCTCCTCC R02：GTCGACTGCAGAATTCGTTCTGCATCTGCTCAAAG P1：CCTTCTCGTTCCTGACAA P2：TGTCAATTCCGCAGGGCA P3：CTGGGGATGAGAATGAAC 二．目的片段制作 1.PCR扩增 1-1.使用PrimeSTAR.HS DNA Polymerase（Code No.DR010S），对质粒进行PCR扩增。 反应体系：APPwild（10 ng/ul），1 ul；Primer*1（0.01 OD/ul），0.5 ul；Primer*2（0.01 OD/ul），0.5 ul；dNTP Mixture（各2.5 mM），4 ul；5times;PrimeSTAR Buffer（Mg2＋ plus） 10 ul，PrimeSTAR HS DNA Polymerase（2.5 U/ul），0.5 ul，dH2OUp to50 ul。 反应条件98℃，10 sec；55℃，10 sec；72℃，2 min；30 Cycles；72℃，10 min，1 Cycle *1代表引物F01、F02。 *2代表引物R01、R02。 1-2.将引物F01/ R01、F02/ R02的扩增产物，分别命名为PCR产物Ⅰ、PCR产物Ⅱ，取5 ul进行1%琼脂糖凝胶电泳。 2.PCR产物纯化 将上述PCR产物使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0（Code No.DV805A）分别进行切胶回收后，分别命名为InsertⅠ，InsertⅡ。 三．载体制作 1.将pEGFP-N2，使用EcoR Ⅰ进行酶切 反应体系：pEGFP-N2（200 ng/ul），5 ul；10times;H Buffer，5 ul；EcoR Ⅰ，1 ul；dH2O，Up to 50 ul. 反应条件：37 ℃ 4 hours 2.取5 ul进行1% 琼脂糖凝胶电泳 3．载体回收 使用TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0（Code No.DV805A）切胶回收约4.7kbp的DNA片段后，命名为Vector DNA。 四．In-Fusion、转化、阳性克隆筛选及质粒测序 使用In-FusionTM Advantage PCR Clon