质谱技术在蛋白质鉴定中的应用.pptVIP

质谱技术在蛋白质鉴定中的应用 内容 质谱的发展背景 质谱分析原理及质谱仪 质谱技术在蛋白质鉴定中的应用 串联质谱鉴定蛋白质方法 蛋白质鉴定的算法（Sequest） 蛋白质的分析研究内容主要包括分子量测定，氨基酸鉴定，蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展，仪器分析手段的更新，尤其是质谱分析技术的不断成熟，使这一领域的研究发展迅速 。 自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来，随着生命科学及生物技术的迅速发展，生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一，在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位。 蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子，复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级，三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。 四、质谱的应用 相对分子质量的测定 利用分子离子峰的m/z可准确地确定该化合物的相对分子质量。一般来说，除同位素峰外，分子离子峰一定是质谱图上质量数最大的峰 化学式的确定 一般是通过同位素峰相对强度来确定有机化合物的分子式。计算同位素（M+1）/M和（M+2）/M强度百分比，再结合其它规律，确定化合物的化学式。 结构式的确定 确定化合物的相对分子质量及分子式，计算不饱和度，根据分子离子峰和高质量碎片离子峰之间的m/z差值，找到分子离子可能脱掉的中性分子或自由基，推导分子结构类型。 蛋白质的质谱分析中离子化方式 电喷雾离子化 Electrospray Ionisation (ESI) 基体辅助激光解吸离子化 Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI) 电喷雾离子化 基体辅助激光解吸离子化 质谱用于肽和蛋白质的序列测定主要可以分为三种方法： 第一种方法叫蛋白图谱(proteinmapping)，即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段，然后用质谱检测各产物肽分子量，将所得到的肽谱数据输入数据库，搜索与之相对应的已知蛋白，从而获取待测蛋白序列。将蛋白质绘制“肽图”是一重要测列方法。 第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子，通过分析相邻同组类型峰的质量差，识别相应的氨基酸残基，其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂. 第三种方法与Edman法有相似之处，即用化学探针或酶解使蛋白或肽从Ｎ端或Ｃ端逐一降解下氨基酸残基，形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽，名为梯状测序(laddersequencing)，经质谱检测，由相邻峰的质量差知道相应氨基酸残基。 串联质谱鉴定蛋白质方法 串联质谱：两个或更多的质谱连接在一起，称为串联质谱。最简单的串联质谱（MS/MS）由两个质谱串联而成，其中第一个质量分析器（MS1）将离子预分离或加能量修饰，由第二级质量分析器（MS2）分析结果。 最常见的串联质谱为三级四极杆串联质谱。第一级和第三级四极杆分析器分别为MS1和MS2，第二级四极杆分析器所起作用是将从MS1得到的各个峰进行轰击，实现母离子碎裂后进入MS2再行分析。现在出现了多种质量分析器组成的串联质谱，如四极杆-飞行时间串联质谱（Q-TOF）和飞行时间－飞行时间（TOF-TOF）串联质谱等，大大扩展了应用范围。离子阱和傅里叶变换分析器可在不同时间顺序实现时间序列多级质谱扫描功能。 MS/MS最基本的功能包括能说明MS1中的母离子和MS2中的子离子间的联系。根据MS1和MS2的扫描模式，如子离子扫描、母离子扫描和中性碎片丢失扫描，可以查明不同质量数离子间的关系。母离子的碎裂可以通过以下方式实现：碰撞诱导解离，表面诱导解离和激光诱导解离。不用激发即可解离则称为亚稳态分解。 利用串联质谱鉴定蛋白质通常有三种方法: 1) 查询蛋白质序列数据库. 这是目前鉴定蛋白质最常用的方法. 2) 从头测序(de novo peptide sequencing). 针对数据库里没有的新蛋白或发生翻译后修饰等情况的蛋白质, 不依赖数据库而直接利用质量较好的串联质谱推理获得序列信息. 3) 首先用从头测序方法获得高可信度的序列片段(tag), 然后利用这些片段辅助查询蛋白质数据库, 是前两种方法的结合. 蛋白质鉴定的算法（ Sequest ） 用串联质谱查询数据库鉴定蛋白质的核心部分是实验串联质谱