实验十七实时荧光pcr检测沙门氏菌salmonella.doc

实验十七、实时荧光PCR检测沙门氏菌(salmonella .spp) 一、实验目的： 学习采用实时荧光PCR仪检测食品、化妆品等中的沙门氏菌(salmonella .spp)的特异检测。 二、实验原理： 试剂盒采用PCR 方法结合荧光探针的体外扩增和检测技术，适用于食品、卫生防疫、化妆品等沙门氏菌(salmonella .spp)的特异检测。 三、仪器与试剂： 1、试剂盒组成 组成成份(48T/kit) 规格 DNA提取液 3ml　　　1管 PCR反应液 1100ul　　1管 Taq 酶 25ul　　　1管 UNG酶 5ul　　　1管 阳性对照 1ml　　　1管 阴性对照 1ml　　　1管 2、仪器 Roche lightcycler, ABI系列，MJ opticon2，Bio-Rad和博日line-gene荧光PCR检测仪 四、实验步骤： 样品的收集及处理以及增菌培养 严格按照无菌操作规程称取25g样品按国标法进行增菌培养。增菌样品可暂存4℃冰箱，24小时内检验。 使用方法（使用前请仔细阅读本操作流程） 1、增菌液处理（样本处理区） 增菌液的处理可以采取以下方法： 　　取待测样本增菌液1ml加到1.5ml无菌离心管中，8,000rpm离心5min，尽量吸弃上清；加入50ul DNA提取液（使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后沸水浴5min，13,000rpm离心5min，取上清保存于-20℃备用以待检测。 2、扩增试剂准备（PCR 前准备区） 从试剂盒中取出PCR 反应液，室温融化并振荡混匀，取出Taq酶及UNG酶，每一次使用时2000rpm离心10sec，以收集粘在管壁上的酶贮液。 设所需要的PCR反应管管数为n（n = 1管阴性对照+ 1管阳性对照+样本数），每个测试反应体系配制如下表： 试剂 PCR反应液 Taq酶 UNG酶 用量(μL) 22.5 0.5 0.06 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管中，颠倒混匀，2000rpm离心10sec，向设定的n个PCR 反应管中分别加入23ul，转移至样本处理区。 3、加样（样本处理区） 若样本裂解产物保存在-20℃，使用前置室温解冻，以13,000rpm 离心5min。 阴、阳性对照使用前置室温解冻，混匀。 向所设定的n个PCR反应管中分别加入步骤1中处理过的样本各2ul，阴性对照、阳性对照解冻后取2ul加入相应的反应管中，盖紧管盖，将PCR反应管转移至检测区，置于PCR仪上，记录样本摆放顺序。 4、PCR 扩增（检测区） Roche仪器：A.循环条件设置 Program Cycles Temperature (℃) Incubation Time (min:sec) Temperature transition Rate (℃/sec) Acquisition Mode Analysis Mode 1 1 37 5:00 20 None None 2 1 93 3:00 20 None None 3 40 93 5 20 None quantification 60 40 20 Single 4 1 40 0 20 None None B.仪器检测通道选择：选择 F1 通道。 其它荧光PCR仪： 37℃：5 min，1个循环；95℃：3 min, 1个循环； 95℃：5 sec, 60℃: 40 sec(收集荧光), 40个循环。反应体系设为25ul。 对于多通道荧光PCR仪，荧光信号收集时设定为Fam荧光素。 荧光PCR仪的使用请参阅详细使用手册。 五、结果分析条件设定： 使用Roche 荧光PCR检测仪 选择F1或F1/F2通道（建议选择F1/F2通道），点击 Quantification 进入定量分析窗口。 2、在 Quantification 窗口中，设定 Analysis 方式为 Fit points , Adjustment 方式为proportional；选定 Noise band 项，阈值（Noise band cursor）设定以刚超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且 Ct 值不出现任何数值为准，也可根据仪器的实际情况进行调整。 使用ABI系列荧光PCR 检测仪进行结果分析时基线（baseline）的确定：取3—10 或3—15 个循环的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且不出现Ct值为准。 使用博日Line-Gene荧光PCR检测仪时，在运行扩增程序前，先把增益值调至30左右。运行结束后点击数据分析进入结果分析界面，选择样点拟合法进行结果分析：零点调整取1－10 或1－15 个循环的荧光信