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人畜共患传染病防治研究新成果汇编
抗猪肺炎支原体特异性P36蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
胡茂志’，焦新安1’“，潘志明2，黄金林2，邵国青‘，刘秀梵3
(1．扬州大学农业部盲禽传染病学重点开放实验室，2 009
扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州，225
3．江苏省农业科学院兽医研究所，江苏南京，2100l4)
清和沉淀。可溶性表达产物亲和层析纯化后用于检测；同时，用GST．P36包涵体沉淀腹腔注射免疫BALB，c
小鼠(400pg，只)。利用淋巴细胞杂交癌技术，获得了一株能分泌特异性抗体的单克隆细胞株5A7-2。生
种特异性抗原表位，并且重组136蛋白的抗体也不与其它支原体或细菌反应，因此，其单克隆抗体的制备，
为Mhp种特异性检测方法的建立奠定了基础。
关键词：猪肺炎支原体P36蛋白单克隆抗体
Pneumonia
猪气喘病也称猪支原体性肺炎(MyeoplasmaofSwine，MPS)．是由猪肺炎支原体
(Mycoplasma
生长发育不良，一般死亡率不高，但由于破坏呼吸道粘膜．纤毛屏障，容易继发其他病原的感染，可能引
起死亡，严重危害养猪业Ilol。
目前，关于MPS的诊断方法，raj,b研究较多，而国内报道甚少。通过研究其特异性蛋白而建立诊断
此，P36蛋白可以作为建立MPS诊断方法的优选抗原。本试验在已获得P36基因重组表达菌的基础上，
而为建立相应的快速检测方法奠定了基础。
1 材料与方法
1．1菌株与质粒Mhp
为扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室保存。
GSTPurificationModules为Amersham
RediPack
and
义平博士惠增；Bulk
标记的羊抗鼠IgG、IgM和鼠源单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自Sigma公司。
学农业部畜禽传染病学重点开放实验室保存。
1．4抗原处理Mhp
mM的IPTG诱导，高
接种LB(Amp+)液体培养基，待其生长到OD6∞在0．6--0．8时，加入终浓度为0．1
速离心并用PBS悬浮菌体沉淀。悬浮物经过超声波裂解后，高速离心，分别收集上清和沉淀。用GST亲
人畜共患传染病防治研究新成果汇编
和层析柱纯化可溶性表达产物。用SDS．PAGE电泳鉴定。
1．5动物免疫参照有关文献I方法进行。用上述包涵体抗原免疫小鼠，每次注射前均与等量佐剂混合，
问隔均为两周。首次免疫用此抗原与弗氏完全佐剂乳化后，腹腔注射，40011
g／只；后三次免疫用此抗原
u
白，100
g／只。
1．6细胞融合按照文献”o方法进行融合。尾静脉追加免疫3天后，眼球采血，分离血清作为阳性对照。
细胞，融合好的细胞用HAT培养基悬浮，分装96孔板进行培养。
1．7
u u孔，37C水浴2
白和GST蛋白的最佳包被浓度，然后分别稀释至2 h；用PBST
g／ml包被酶标板，50u
h，然后4C过夜：同上洗涤后．．200保存备用。杂交瘤筛选程序如下：
洗涤后，进行封闭，370水浴2
v孔，37C水浴2
用以上处理过的酶标板，首先加入杂交瘤培养上清50u h：洗涤后，加入工作浓度HRP
标记的羊抗鼠(19G+lgM)，370水浴2
而不与GST蛋白反应的细胞克隆判为阳性。初步判定为阳性的细胞克隆按有限稀释法2次克隆化后，
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