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实验3 相差显微镜的使用 相差显微镜的原理：在人的视觉中，波长的变化表现为颜色的不同，振幅变化变现为明暗不同，而相位的变化肉眼感觉不到的，即人眼只能区分光波的波长（颜色）和振幅（亮度），不能区分相位。当光线通过无色通明的生物标本时，波长和振幅变化不大，只有相位发生了变化，因此在明场观察时很难观察到标本（图？）。 当照明光线通过活细胞时，虽然波长及振幅没有明显的变化，但由于细胞的各部分及细胞与周围介质之间折射率有所差别，光线通过各种界面时，一部分直接通过细胞称为直射光，另一部分变为衍射光，衍射光与直射光的波长一致，但衍射光的相位比直射光大约推迟约1/4个波长(λ)。从标本某一点发出的直射光和衍射光经物镜会聚以后，在物镜的像场交于一点，衍射光与直射光就会发生干涉，而形成合成光波。合成光的波长仍和原来相同。但振幅为两束光的几何叠加。相差显微镜利用光的衍射和干涉特性，在光学系统中增加了特殊装置：在聚光镜上加了一个环状光阑，在物镜后焦面上加了一个相板，可利用被检物体的光程之差进行镜检，有效地利用光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，因此，可以观察无色透明的物质，大大便利了活体细胞的观察。改变相位由相板完成。如果推迟直射光的相位1/4λ，则直射光和衍射光的相位相同，发生相长干涉，合成光将比直射光明亮，成为负反差。如果推迟衍射光的相位1/4λ，则直射光比衍射光超前1/2λ，这时发生相消干涉，合成光比直射光暗，成为正反差。 图 相差显微镜原理示意图（安利国，2004） 相差显微镜的装置：相差显微镜有一些特殊的装置而有别于明视野显微镜。 相差聚光镜：位于镜台之下，由聚光镜和环状光阑（Ring slit）构成。环状光阑装在聚光镜的下方，而与聚光镜组合为相衬聚光镜。环状光阑使直射光成筒状射向标本面，然后在物镜后焦面聚焦形成一个光环；在标本面上发散的衍射光在到达物镜后焦面时不能聚焦成光环而是分散在光环之外，这样使直射光和衍射光在后焦面被分开。环状光阑装配在一个可旋转的转盘上，外面标有10X、20X、40X、100X等字样，按需要调转使用。环状光阑的环宽与直径各不相同，与不同放大率的相差物镜内的相板相匹配，不可滥用。 相差物镜：相差物镜（phase contrast objective）是相差显微镜中特有的装置。在相差物镜的后焦面上装有种类不同的相板（phase plate），相板分为两部分，一是通过直射光的部分，为半透明的环状，叫共轭面（conjugate area）；另一是通过衍射光的部分，叫补偿面（complementary area）。相差物镜可分为10X、20X、40X、100X等几种物镜。根据相板不同可分为明反差（bright contrast）物镜和暗反差（dark contrast）物镜。镜头外部注有“PH”、“NH”、“NM”等符号。 对中目镜：对中目镜（centering telescope）为一简单望远镜。可插入镜筒观察相板的共轭圈与光阑的合轴程度。 绿色滤片（green filter）：从色差消除情况来看，相差显微镜的种类多属消色差物镜。消色差物镜的最佳清晰范围的光谱区为510～630nm，要提高相差显微镜的性能最好以波长范围小的单色光照明，即接近物镜最清晰范围的波长的光线进行照明。所以使用相差物镜使，在光路上加用透射光线波长为500～600nm左右的绿色滤片，使光线中的红光和蓝光被吸收，只透过绿光，可提高物镜的分辨能力。同时绿色滤片兼有吸热的作用，以利于活体观察。 【实验目的】 掌握相差显微镜（phase contrast microscope）的原理、构造、使用方法及其用途。 【实验器具和材料】 材料：细菌装片、紫鸭跖草花丝装片 器材：相差显微镜、载玻片、盖玻片、擦镜纸等 【实验方法和步骤】 （1）制作一张细菌装片或一张紫鸭跖草花丝装片。 （2）装好相差聚光镜、相差物镜和绿色滤片，打开光源。 （3）安放好标本，调节好照明光强度，将聚光器转盘旋到“0”，找到观察物，调好焦距。 （4）根据镜头倍数选好相应的环状光阑，取下目镜，插入对中目镜，旋松对中目镜上的固紧螺钉并轴向抽动接目镜，使相差物镜中的相板、相差聚光镜环板成像清晰，再旋紧对中目镜上的固紧螺钉。 （5）把调节扳手插入相差聚光镜转盘两后侧面的孔内，调节环板中心，使环板的亮环和相板的暗环重合，不得有漏光现象，此时相差装置调节完毕。注意：每次换镜头或换标本时都要进行合轴调节，否则显微成像效果不佳。 （6）取下对中目镜即可进行相差观察。 【作业】 轮流观察三种物镜（暗反差、明反差、普通物镜）的效果并填表。 表 相差显微镜观察结果 镜头编号 A B C D E F 标本明暗 背景明暗 图像清晰程度 镜头类型