枯草杆菌生物素操纵子基因的克隆与功能表达研讨.pdfVIP

枯草杆菌生物素操纵子基因的克隆与功能表达研究 研究生:杨朝霞 导师:郁枫副教授 樊俊华研究员 西北农林科技大学 摘 要 本研究以大肠杆菌 (二.coli)克隆载体pUC19为模板，分别用两对引物扩增了含有 复制起始序列(on)和复制蛋白基因((rep)的700bp片段，以枯草芽抱杆菌(B.subtilis) 质粒载体pGDVI为基本骨架，构建了三个带有氯霉素抗性基因的大肠杆菌一枯草芽抱 杆菌小型穿梭载体pGDVM,pGDVM1和pGDVM2。经大肠杆菌一枯草杆菌反复穿梭 实验和细菌连续培养分析检测，结果证明:含大肠杆菌pUC19复制起始区 (on)和复 制起始蛋白基因(rep)的700bp克隆片段在大肠杆菌中具有完全的复制功能:构建的三 个质粒载体在大肠杆菌和枯草杆菌中能稳定地遗传。这三个穿梭质粒载体分子较小，仅 3kb左右;具有较高的拷贝数 (在枯草杆菌中约150-200拷贝数)，带有多个不同的克隆 位点，方便插入目标基因，并且带有氯霉素抗性基因，可以为受体菌提供理想的抗性筛 选标记。该系列载体可以作为枯草杆菌理想的基因工程菌构建骨架。 本研究成功地克隆了枯草杆菌生物素操纵子基因bioB,bioW和基因簇bioWAFDB 片段;以大肠杆菌表达质粒载体pEXT2。为骨架，分别构建了bioW,bioB和bioWAFDB 诱导型表达载体pEXT20bioW,pEXT20bioB和pEXT20bioWAFDB，可以通过IPTG诱 导，在大肠杆菌中进行表达。通过它们与大肠杆菌生物素生物合成基因系列bioF,bioB, bioC,bioD和bioA缺陷株R874,R875,R876,R877和R879的遗传互补实验，证明: 枯草杆菌生物素基因bioA,bioB,bioD和 bioF在大肠杆菌中功能正常;bioW基因(编 码庚二酞CoA合成酶)的表达载体对大肠杆菌缺陷株没有遗传互补作用，但是bioW 基因编码的庚二酞CoA合成酶在大肠杆菌中有催化活性，可以催化外源的庚二酸合成 庚二酞CoA，为生物素合成途径提供底物。经过IPTG不同水平的诱导表达实验，发现: 枯草杆菌生物素基因bioWAFDB的过量表达对受体菌的生长有严重抑制作用，该抑制作 用主要是由bioW引起，并且不能通过添加二氨基庚二酸而解除。枯草杆菌bioB基因诱 导表达产物未对大肠杆菌的生长造成抑制，实验结果为枯草杆菌生物素基因工程菌的构 建及生物素发酵生产提供了有价值的理论依据。 关键词:枯草杆菌:大肠杆菌;穿梭载体;生物素操纵子基因;诱导表达 StudyonCloningandFunctionalExpressionof BiotinOperonGenesinB.subtilis M.DCandidate: YangZhaoxia ervtsor: Sup YuFeng,Fan7unhua Abstract TwoDNAfragments,whichareabout700bpsandcontainonandrepofEcoli,were clonedfrompUC19usingtwopairsofprimersrespectively.ThreeEcoli-B.subtilisshuttle vectorspGDVM,pGDVMIandpGDVM2whithchloramphenicolresistance,werethen consturctedwiththeframeworkpGDV1，aplasmidcomerfomRsubtilisstrain1E60.It indicatesthatthecloned700byDNAfragmentscontainsonandrepofEcolihavea completeabilityofreplication,andthethreeshuttlevectorscaninheritandclonesteadilyvia continuouscu