昆虫抗菌肽Thanatin+N端长臂与生物功能的关系研究.pdfVIP

昆虫抗菌肽Thanatin N端长臂 与生物功能的关系 翁宏飚牛宝龙孟智启 (浙江省农业科学院蚕桑研究所，杭州310021) 摘 要：在抗菌肽Thanatin中有4个结构域与抗菌活性相关，本文对其中结构变化较大的N端 长臂区进行突变，对突变体进行体内活性分析，并化学合成野生抗菌肽及其突变体，体外进 行抗菌活性测定，分析了抗菌肽Thanatin的N端长臂与活性的关系。 关键词：抗菌肽；化学合成；抗菌活性；结构一功能关系。 Thanatin是一种从刺蝽中分离得到，在迄今为止所有已知昆虫抗菌肽中抗菌谱最广、抗菌活性 生物产生影响，其抑菌的最小基序由c端环和相邻残基组成，C末端Met残基的酰氨化对其抗菌活性 Thanatin分子从第8位残基到c末端可形成标准的B一反向平行折叠结构，N端结构高度可变，c端 侧链埋藏于N端疏水带中的结构可能是活性非必需结构。 列进行突变，打断在天然肽中的N端疏水带结构。利用宿主菌对GST一抗菌肽融合蛋白的内源敏 性。 1．材料和方法 1．1实验材料 DNA TGl、BL21为本实验室保存；Taq 表达质粒pGEX一4T一1；质粒pGEX一4T—Thanatin；E．coli 聚合酶TaKaRa公司产品；pGEM Glutathione 品；IPTG购自Sigma公司；基因突变引物由上海生工生物工程公司合成；Pre—packed 4B column为Phamacia公司产品。 Sepharose 1．2方法 1．2．1Thanatin突变体基因的克隆及融合表达载体的构建 YPVPII．形成突变体Thanatin7。载体构建方法参照分子克隆手册。 一24— 1．2．2融合蛋白的大量表达、纯化和抗菌活性分析 转入含25mg／L氨苄青霉素的LB培养基，37cC振荡2h后加入I肌G(终浓度为0．5mmo此)诱导表 达，4h后收集菌体，超声破碎，离心。上清go．45p。m滤膜过滤后，k：G1utathinone4B预 Sepharose ()．5mg／ml，测量280nm下的吸光度以确定融合蛋白产量。以琼脂糖空穴扩散法分析融合蛋白的抗菌 活性。 1．2．3抗菌肽体内活性检测方法的建立 DU IPTG诱导融合蛋白表达。用Beckman 640@分光光度计每隔--d,时测定菌液0D。，。吸光值，绘制 宿主菌生长曲线。分别调查IPTG浓度、宿主菌种类、诱导起始菌浓度对宿主菌生长抑制曲线的影 响，优化体内活性检测方法。 1．2．4利用体内抗菌活性检测方法分析突变体活性 将含有不同重组质粒pGEX一4T—Thanatin、pGEX一4T—Thanatin7的宿主菌，37℃培养过夜，次日 分别按比例转接新鲜LB培养基，并利用LB培养基调节各种菌液浓度，使各个菌的起始浓度一致． 37℃培养，以最适IPTG浓度、诱导起始菌浓度诱导融合蛋白表达。用BeckmanDU640型分光光度计 物活性。 1-2．5Thanatin：杀弘,突变体Thanatin’的体外抗菌活性分析 mMol／L 取亲和层析后的融合蛋白各5mg溶=J：PBS缓冲液中，加入50U肠激酶。35℃温育16h，加2 补LB至300斗L，37℃培养3．5h，测定OD650坌Ⅲ菌浓度。以培养液中所含酶切产物量对相对吸光度作图。 1．2．6Thanatin和突变体的化学合成及抗茵谱分析 85％。琼脂凝胶平板法检测抗菌肽对供试菌的抗菌活性。 1．2．7突变体的分子动力学模拟