生物物质分离与提纯.doc

第一章 绪论 一、生物分离纯化的概念 指从发酵液、动植物细胞培养液、酶反应液或动植物组织细胞与体液等中分离、纯化生物产品的过程。 二、生物物质及来源 生物物质：①氨基酸及其衍生物②活性多肽类③蛋白质类④酶类⑤核酸及其降解物类⑥糖类⑦脂质类⑧动物器官或组织制剂⑨小动物制剂⑩菌体制剂 来源：①动物器官与组织②植物器官与组织③微生物及其代谢物④细胞培养产物⑤血液、分泌物及其代谢物 三、生物分离纯化技术的特点： ①环境复杂、分离纯化困难②含量低、工艺复杂③稳定性差、操作要求严格④目标产物最终的质量要求很高⑤最终产品纯度的均一性与化学分离上的纯度的概念不完全相同 四、分离纯化方法选择的原则 ①技术路线、工艺流程尽量简化②尽可能采用低成本的材料与设备③将完整工艺流程划分为不同的工序④注意时效性⑤采用成熟技术和可靠设备⑥检测纯化过程中产物产量和活性 五、原材料的选择 1.与目标产物含量相关的因素：合适的生物品种；合适的组织器官；生物材料的种属特异性；合适的生长发育阶段；合适的生理状态 2.天然生物材料的采后处理：①原因：细胞自溶导致目标产物失活或降解；易受微生物污染导致目标产物失活或降解；易受光照、氧气等的作用导致其分子结构改变。②一般植物材料需进行适当的干燥后再保存；动物材料须经清洗后速冻、有机溶剂脱水或制成丙酮粉在低温下保存 六、成品的保存：①影响生物产品保存的主要因素：空气（避空气）；温度（低温）；水分（干燥），光线（避光）；pH（缓冲液）；保存期 ②蛋白质和酶制品的保存方法；低温保存（-20~5 ℃， -70℃最好）；制成干粉或结晶保存；保存时添加保护剂：a.惰性的生化或有机化合物（糖类、脂肪酸、牛血清白蛋白、氨基酸、多元醇等）b.中性盐（MgSO4 、 NaCl 、(NH4)2SO4等）c.巯基试剂（半胱氨酸或巯基乙醇） 七、分离纯化的基本步骤：发酵液的预处理；固液分离；初步纯化（分离提取）；高度纯化（精制）；成品加工 第二章 发酵液的预处理和固液分离 一、预处理的目的：促进从悬浮液中分离固形物的速度，提高固液分离的效率：⑴改变发酵液的物理性质，包括增大悬浮液中固体粒子的尺寸，降低液体黏度。⑵ 相对纯化，去除发酵液中的部分杂质（高价无机离子和杂蛋白质），以利于后续各步操作。 方法：凝聚和絮凝； 加热法；调节悬浮液的PH值；杂蛋白的去除；高价无机离子的去除；助滤剂和反应剂 凝聚：指在投加的化学物质（铝、铁的盐类）作用下，胶体脱稳并使粒子相互聚集成１ mm 大小块状凝聚体的过程。 机理：中和粒子表面电荷；消除双电层结构；破坏水化膜。 絮凝：指使用絮凝剂（天然的和合成的大分子量聚电解质）将胶体粒子交联成网，形成10mm大小絮凝团的过程。其中絮凝剂主要起架桥作用。 机理：架桥作用，絮凝剂通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生架桥联结时，就形成较大絮团，产生絮凝作用。 絮凝的影响因素：发酵液的性质（细胞浓度，表面电荷）；絮凝剂的浓度，最佳用量为粒子表面积约有一 半被聚合物覆盖；絮凝剂的分子量；pH 控制；搅拌速度。 常见絮凝剂：人工合成有机高分子聚合物（聚丙烯酰胺类衍生物、聚乙烯亚胺衍生物；聚丙烯酸类和聚苯乙烯类衍生物）、天然有机高分子聚合物、无机高分子聚合物、微生物絮凝剂 杂蛋白的去除：①沉淀法（等电点沉淀法；酸碱调节，使蛋白质与离子形成沉淀）②变性（加热；大幅度调节pH值；加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等）③吸附法（加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白而除去） 固液分离方法：过滤；离心；膜分离；双水相萃取 设备：实验室用抽滤装置。工业生产：板框压滤机（间歇操作）；转筒真空过滤机（连续操作）；过滤式离心机；硅藻土过滤机 离心机种类和用途：按速度和离心力：1、常速离心机 最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)10E4g以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离；2、高速（冷冻）离心机 1×10E4---2.5×10E4rpm，相对离心力10E4~10E5g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离；3、超速离心机 转速2.5---8×10E4rpm，相对离心力5×10E5g；用于DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。 对于常速和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和时间，就能达到分离效果。超速离心的离心方法：差速离心、密度梯度离心和等密度梯度离心。 按离心机的作用方式：斜角式；平抛式；管式；蝶式；螺旋式；多室 第三章 细胞破碎 破碎方式：1.机械法：固体剪切作用（珠磨法，压榨，研磨）；液体剪切作用（高压匀浆，超声破碎）；2.非机械法：干燥处理；溶胞作用（酶溶