生物工艺学 第十四章 沉淀法.ppt

第十四章 沉淀法 一、盐析法 4、影响盐析作用的因素 （1）、盐的种类 不同种类的盐对溶解度有很大的影响，其中阴离子的影响较显著，阳离子的影响是第二位的。 含高价阴离子的盐，效果比1—1价的盐好。高价阳离子的效果不如低价阳离子。 阴、阳离子的盐析效果有下列次序： 因此，最常用的盐析剂是硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾或磷酸钠。 硫酸钠在40 ℃以下溶解度较低，因而仅适用于对热稳定的蛋白质。磷酸盐在中性范围内实际上是HPO42-和比PO43—的混合物，其作用比P043-差。硫酸铵由于价廉、溶解度大，且能使蛋白质稳定(在2—3mol/l(NH4)2S04中酶可保存几年，同时由于盐的浓度高，可防止蛋白酶和细菌作用)，故是最常用的盐析剂： 硫酸铵的缺点是水解后变酸，在高pH下会释放出氨；腐蚀性强；残留的硫酸铵在食品中虽然量少，也会影响其味，在医疗上有毒，因此必须除去。 （2）、pH值和温度 蛋白质在pI时的溶解度最小。进行盐析时的pH，要选择在被分离蛋白质的pI附近 一般在室温下进行，浓盐对蛋白质有保护作用。但对温度敏感的，要在低温下进行。 常在0-4 ℃范围内迅速操作。如尿激酶。 （4）、蛋白质的浓度 在相同条件下，蛋白质浓度越大越易沉淀，使用盐的饱和度极限也愈低。蛋白质浓度愈高，其他蛋白质共沉作用也愈强，这是不希望的。选择适当的蛋白质浓度，可避免共沉的干扰。 二、等电点沉淀法 蛋白质的离子化既与蛋白质的详细结构有关，也与溶液的pH值有关。 一般来说，溶液的pH值高，蛋白质带负电，pH值低，蛋白质带正电，当溶液的pH值为某一值时，蛋白质几乎不带电，即净电荷为零，或者说它带相等的正电和负电，这时的pH值称为等电点，常用pI表示。 三、有机溶剂沉淀法 4、使用时应注意的问题 （1）、降低温度，能增加收率和减少蛋白质的变性。 （2）、所选择的溶剂必须能和水互溶，而和蛋白质不起作用，最常用的溶剂是乙醇和丙酮。 （3）、蛋白质的分子量越大．产生沉淀所需加入的有机溶剂量越少。 （4）、一种蛋白质的溶解度通常会由于另一蛋白质的存在而降低。 (5)、沉淀的蛋白质如不能再溶解，就可能已经变性。 四、非离子型聚合物沉淀法 五、聚电解质沉淀法 加入聚电解质的作用和絮凝剂类似，同时还兼有一些盐析和降低水化等作用 缺点：往往会使蛋白质结构改变，但它们应用于酶和食品蛋白的回收中，因而值得注意。 常用聚电解质： （1）离子型多糖化合物。应用于沉淀食品蛋白质。用得较多的是酸性多糖，如羧甲基纤维素，海藻酸盐，果胶酸盐和卡拉胶等。它们的作用主要是静电引力。如羧甲基纤维素能在pH低于等电点时使蛋白质沉淀。和其他絮凝剂一样，加入量不能太多，否则会引起胶溶作用而重新溶解。 六、金属离子沉淀法 一些高价金属离子对沉淀蛋白质很有效。它们可以分为三类。 第一类为Mn2+，Fe2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+和Cd2+。能和羧酸，含氮化合物如胺以及杂环化合物相结合； 第二类为Ca2+，Ba2+，Mg2+和Pb2+.能和羧酸结合，但不和含氮化合物相结合； 第三类为Ag+，Hg2+和Pb2+.能和巯基相结合。 金属离子沉淀法的优点：它们在稀溶液中对蛋白质有较强的沉淀能力。处理后残余的金属离子可用离子交换树脂或螯合剂除去。 1、基本原理 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。其原理主要是： ①降低水溶液的介电常数，向溶液中加入有机溶剂能降低溶液的介电常数，减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，导致蛋白质溶解度降低而沉淀。 ②由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏了蛋白质分子的水膜，因而发生沉淀作用。 有机溶剂沉淀法的优点是： ①分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围内沉淀。 ②沉淀不用脱盐，过滤比较容易（如有必要，可用透析袋脱有机溶剂）。因而在生化制备中有广泛的应用。 其缺点是：对某些具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作需在低温下进行。 2、有机溶剂的选择 对有机溶剂的要求： （１）介电常数小。 （２）对生物分子变性小。 （３）毒性小、挥发性适中。 （４）能与水无限混溶。 常用的溶剂： 乙醇：具有上述的特点。 丙酮：沉淀作用大于乙醇，量可减少１／４～１／３，但是沸点比乙醇低，对肝脏有一定的毒害作用。着火点低。 甲醇：沉淀作用与乙醇相当，但对蛋白质的变性作用比乙醇、丙酮小，由于口服毒性大，限制其使用。 其他：二甲基亚砜、乙睛、二甲基甲酰胺 3、有机溶剂沉淀的影响因素 1) 温度：多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有机溶剂中对温度特别