梨火疫病菌的分子检测技术研讨.pdf

染火疫病菌的分子检测技术研究 摘 要 本论文主要进行了梨火疫病菌检测技术研究。 选用梨火疫病菌的0056菌株，由戊二醛固定全菌体杭原，制备的杭血清效价和 专化性都较高，可以用于ELIS人实验。 利用免疚吸附技术，研制了免疫吸附一PCR技术，使其检测纯菌的灵敏度比标准 PCR技术提高10倍;检测样品中的梨火疫病菌灵敏度提高了1000倍;从相关混合菌 液中能够更加灵敏和准确地检测出梁火疫病菌。该方法简单易行，准确灵敏，具有广 阔的应用前景，也是直接利用PCR反应管吸附病原细菌提高PCR反应灵敏度的首次报 道。利用本实验室自行设计的梨火疫病菌特异性引物REA-FEA，再次验证了免疫吸附 -PCR技术的灵敏性和专化性，得到了同样的结果. 选用16S-23SrDNA间的ITS(IntergenicTranscribedSpacerRegion)序列的 通用引物Ll(5-AGTCGTAACAAGGTAGCCGT-3)和L2(5-GTGCCAAGGCATCCACC-3) 对梨火疫病菌共10个菌种进行了工TS扩增，所有菌株均得到了一条分子量约为600bp 的扩增产物。对参试的10个梨火疫病菌的扩增片段进行片段回收、克隆和测序，将 这些序列与数据库中已经报道的其它ITS序列进行同源性比较，在此基拙上设计并合 成梨火疫病菌特异性引物REA-FBA。并用这对特异性引物分别对 25个参试菌株进行 PCR扩增。证明这对特异性引物具有很高的专化性. 本研究还建立了在一个试管中一次完成的检测梨火疫病菌的单管Nested-PCR技 术，利用细菌基因组16SrDNA通用引物和ITS通用引物对梨火疫病菌及其近缘种菌株 的16SrDNA区域和ITS区域扩增，得出序列，设计并合成了两时引物。一对外部引物 Eaf-Ear和一对内部引物FEA-REA。这两对引物有截然不同的退火温度，整个程序包 括两个连续的PCR程序。把两对引物同时加入PCR体系，第一轮PCR程序在较高的退 火温度下进行，因此只有外部引物起作用。用外部引物第一转扩增后，紧接着再用内 部引物进行第二轮扩增，扩增结果显示，灵敏度比标准PCR技术至少提高100倍，扩 增灵敏度达到5X100cfu/ml的菌悉液.这种Nested-PCR检测技术只能从梨火疫病菌 中扩增出约270bp的特异性条带，而不能从其它细菌菌株中扩增出这条片段。 关键词:梨火疫病菌;检测;内源转录间隔区域 ;免疫吸附一PCR;单管巢式PCR PCR-BASEDTECHNIQUESFORDETECTIONOF ERWINIAAMYLO ABSTRACT: ThisthesishasmainlycarriedonthedetectionmethodsofErwiniaamylovora，the pathogenofpearfireblight werepreparedusing0056strainwholecellsasantigenrespectively.The specificityandsensitivityoftheantiserumwereenoughfortheimmuno-capture-PCR experiment BasedonthestandardPCRfordetectionofErwiniaamylovorapublishedbefore,we developpedtheimmuno-capture-PCRmethod,bywhichcouldenhanced10timesof sensitivityofdetectionpurecultureand1000timesofdetectionofErwiniaamylovorafrom samples.ThiswasthefirstreportofusingthismethodforpromotingofPCRsensitivity. UsingthespecificprimersREA-FEAdesignedinthisworkbyourselves,weprovedthe specificityandsensitivityoftheimmuno-capture-PCRmethodagain.Thesameresulthas beenachieved. UniversalPCRprimers(L1:5-AGTCGTAACAAGGTAGCC