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1.以细胞为基础的载体法 基因克隆简单的说指的是大量产生基因片段的技术。一般有两种方法可以实现基因扩增： 2.使用PCR技术 Kary B. Mullis J3 聚合酶链反应 P161 P161 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction) 简称PCR，它是模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，在体外通过使用一对与靶DNA两端互补配对的引物模拟细胞内DNA复制的机制来扩增DNA片段的技术。 1.PCR反应的过程： DNA解链（90～95℃变性） 退火（45～65 ℃ ） 链延伸（72 ℃） 90~95℃ 72℃ 保温（72 ℃） 72℃ 25~35 cycles PCR技术的特点？ 2.PCR反应体系： PCR反应五要素： 引物、酶、dNTP、模板和缓冲液（Mg2+ ） 标准的PCR反应体系： 　　　10×buffer 　 3 μl 　　　 dNTP　 2 μl 　　　 引物 1 1 μl 引物 2　　　　 　 1 μl　　　　模板DNA 　　　 　 2 μl 　　 　 Taq 酶 　 1.0 U　　　　 Mg2+　　　　　 2 μl 　　　 ddH2O 　 19 μl 2. 引物/ Primers P162 PCR技术之所以能够在短时间内快速准确地将目的序列扩增，其关键在于反应体系中的引物； 引物设计在不违反引物设计原则的基础上时，最为简单但不失为有效的方法是以该目的基因5’端约20个碱基序列做5’端的引物，以该基因3’端20个碱基顺序的互补序列做3’端引物 ； 一对引物在模板DNA上的结合点之间的距离决定了扩增片段的长度（1kb之内是理想的扩增跨度；2kb左右是有效扩增跨度，3kb很难获得有效的扩增）。 ? 微生物多样性分析（16s rDNA） 病原微生物检测（H1N1病毒H基因） 食品中是否含转基因成分（针对其中的转基因植物成分） 动物生物多样性（mtDNA中的Cytb、COI、COII） 食品中病原体检测（沙门氏菌、LM等） 只要能引导DNA相向合成即可作为PCR扩增的引物。 思考：具体PCR的引物如何确定？ 三、PCR扩增产物的分析 　　 PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。 1. 凝胶电泳分析 琼脂糖凝胶电泳 (图.) 聚丙烯酰胺凝胶电泳 2. 分子杂交 是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR产物碱基突变的有效方法。 3. 序列分析 四、PCR 延伸技术 1、反向PCR 2、RT-PCR 3、RAPD 5、AFLP 6、SSR 1、反向PCR： Inverse?PCR。主要用于解决扩增与已知序列相邻的未知DNA片段。原理：用已知片段内部没有的限制性内切酶切割模板?DNA?，再将酶切后的DNA片段连接成环状分子，其中至少有一个环状分子含有完整的已知片段。根据已知片段两端的序列设计引物，可将邻近的DNA片段扩增出来。 克隆已知DNA片段周边的未知片段，即染色体步查. P160 2、RT-PCR：反转录PCR，其模板为RNA包括mRNA、 tRNA、rRNA和病毒RNA。 Reverse?transcriptase?PCR，即以反转录的?cDNA?作模板所进行的?PCR?反应，可用于测定基因表达的强度，还可用于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性，克隆?mRNA?的?5?和?3?末端序列，从非常少量的?mRNA?样品构建大容量的?cDNA?文库。 用逆转录酶将RNA反转录为cDNA； 以cDNA为模板进行PCR。　　 3 RAPD / 随机扩增多态DNA RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA)技术是建立在PCR 基础之上的一种可对整个未知序列的基因组进行多态性分析的分子技术。 RAPD技术现已广泛的应用于生物的品种鉴定、系谱分析及进化关系的研究上。 RAPD以PCR为基础，核心是DNA片段的扩增，与常规PCR不同在于引物。常规PCR需要一对引物，每个引物分子1