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五、蛋白质相对分子量的测定 1.凝胶过滤法测定相对分子质量 Note： 蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子质量，而是分子的半径。 用凝胶过滤法测定分子质量，标准蛋白质（已知Mr）与待测蛋白质必须具有相同的分子形状（球形） 分子形状为线形或能与凝胶发生吸附作用的蛋白质，不能用此法测定。 将已知分子质量的标准物质，在同一凝胶柱上以相同条件进行过滤层析，在一定的范围内，各个组分的洗脱液体积Ve与其分子量的对数成线性关系（反比）： Ve＝－b’ lg MW＋c’ 优点： 设备简单，不要求复杂的仪器 对待测样品的纯度要求不高。待测样品可以是不纯的，只要具有专一的生物活性。 聚丙烯酰胺凝胶：具有三维网状结构和分子筛性质。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状） （二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （SDS） ■ SDS 在蛋白质表面均匀附上一层负电： SDS（十二烷基磺酸钠），它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约1 ? 1.4比例结合。 SDS可将蛋白质解离成亚基，所以测出的分子量是亚基的分子量。 SDS－PAGE的依据：物质分子量的差异性 当SDS与蛋白质结合后： 1)SDS使蛋白质分子即带有大量的负电荷，掩盖了蛋白质分子间的电荷差别 2）改变了蛋白质单体的构象，SDS-蛋白质复合体形状趋向一致，所以各种SDS一蛋白质复合物在电泳时产生的泳动率差异，就反映了分子量的差异。 方法：①用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理 蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成 SDS-蛋白质复合物，使得不同蛋白质分子均带 负电（SDS带负电），且荷质比相同； 不同蛋白质分子具有相似的构象。 ②用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们 的迁移率作图 ③测出待测样品的迁移率 ④从标准曲线上查出样品的相对分子质量 六 蛋白质的含量测定与纯度鉴定： （一）总蛋白质含量测定： 凯氏定氮法：测样品中N含量 双缩脲法：不十分精确，但较简便 Folin-酚试剂(Lowry法)： 蛋白质标准测定方法： 染料结合法（Bradford法）灵敏度较高, ?g水平 染料：考马斯亮蓝 紫外吸收法： A280比色 胶体金法(ng水平) （二）蛋白质的纯度鉴定 电泳：一条带 层析(HPLC)：一个峰 N-末端分析；一种AA 一、单项选择题 1. ?构成蛋白质的氨基酸属于下列哪种氨基酸？（?）。??? A. L-α氨基酸?? B. L-β氨基酸??? C. D-α氨基酸??? D. D-β氨基酸 ?2. ?280nm波长处有吸收峰的氨基酸为（? ）。?? ?? A.精氨酸?????? B.色氨酸???????? C.丝氨酸??????? D.谷氨酸 ?3. ?有关蛋白质三级结构描述，错误的是（??? ）。? ?? A.具有三级结构的多肽链都有生物学活性 ?? B.三级结构是单体蛋白质或亚基的空间结构 ?? C.三级结构的稳定性由次级键维持?? D.亲水基团多位于三级结构的表面 A. L-α氨基酸 B.色氨酸 A.具有三级结构的多肽链都有生物学活性 4. ?关于蛋白质四级结构的正确叙述是（???? ）。 ?? A.蛋白质四级结构的稳定性由二硫键维系 ?? B.四级结构是蛋白质保持生物学活性的必要条件 ?? C.蛋白质都有四级结构 ? D.蛋白质亚基间由非共价键聚合 。 D 二、多项选择题 1. ?蛋白质结构域（?? ? ? ）。 ?? A.都有特定的功能??????????????? B.折叠得较为紧密的区域 ?? C.属于三级结构????????????????? D.存在每一种蛋白质中 2. ?空间构象包括（??? ）。 ?? A. β-折叠????? B.结构域??????? C.亚基???????? D.模序 A B C? ??A B C D 三、名词解释 1. 蛋白质等电点????????????????? ?2. 蛋白质三级结构 3. 蛋白质变性?????????????????? ??4. 模序 ?蛋白质等电点：蛋白质净电荷等于零时溶液的pH值称为该蛋白质的等电点。