第13期在线交流RNA-seq中的基因表达量计算和表达差异分析（上）.PDFVIP

第13期在线交流 RNA-seq中的基因表达量计算和表达 差异分析（上） 交流地点： 腾讯课堂 生信交流QQ I 群（已满） 生信交流QQ II群 425346734 交流时间：2016年3月2 日下午4点 1 背景 • 差异分析的步骤： 1）比对； 2 ）read count计算； 3 ）read count的归一化； 4 ）差异表达分析； 2 背景知识 1）比对 • 普通比对：BWA，SOAP • 开大GAP比对：Tophat （Bowtie2）； 2 ）Read count(多重比对的问题） • 丢弃 • 平均分配 • 利用Unique region估计并重新分配 3 提纲 • 归一化算法介绍以及比较 • 差异分析算法以及比较 4 表达量计算的本质 • 目标基因表达量相对参照系表达量的数值。 参照的本质： （1）假设样本间参照的信号值应该是相同的； （2 ）将样本间参照的观测值校正到同一水平； （3 ）从参照的数值，校正并推算出其他观测量的值。 表达量计算的本质 • 目标基因表达量相对参照系表达量的数值，例如： Qpcr: 目标基因表达量（循环数）相对看家基因表达量（ 循环数）； RNA-seq: 目标基因的表达量（测序reads数），相对样本 RNA总表达量（总测序量的reads数），这是最常用的标 准。 参照系：在样本间数值一致； 归一化的原因及处理原则 1）基因长度 2 ）测序量 3 ）样本特异性（例如，细胞mRNA总量，污染等） 前两者使用普通的RPKM算法就可以良好解决，关 键是第三个问题，涉及到不同的算法处理。 7 RNA-Seq 归一化算法的意义 • 基因表达量归一化：在高通量测序过程中，样品间 在数据总量、基因长度、基因数目、高表达基因分 布甚至同一个基因的不同转录本分布上存在差别。 因此不能直接比较表达量，必须将数据进行归一化 处理。 RNA-seq差异表达分析的一般原则 1）不同样品的基因总表达量相似 2）上调差异表达与下调差异表达整体数量相似（上下 调差异平衡） 3）在两组样品中不受处理效应影响的基因，表达量应 该是相近的（差异不显著）。 4）看家基因可作为表达量评价依据（待定） 不同的算法比较 • 以什么数值来衡量表达量 RPKM、FPKM、TPM • 以什么作为参照标准 TMM （edgeR软件）、De seq矫正 10 RPKM 目标基因的数值 r ：每个基因的reads数； g fl ：每个基因的长度； g 参照的数值