肿瘤相关巨噬细胞通过LXRs受体介导促进肿瘤生长.docVIP

精品论文 参考文献 肿瘤相关巨噬细胞通过LXRs受体介导促进肿瘤生长 王秀珍 (郑州市第一人民医院检验科 450004) 【摘要】目的 研究肿瘤微环境、LXR受体与肿瘤相关巨噬细胞的形成及其功能之间的关系。方法 提取肿瘤模型小鼠肿瘤组织中的肿瘤相关巨噬细胞，以模型小鼠腹腔巨噬细胞作为对照。采用肿瘤细胞与巨噬细胞共培养或者应用肿瘤上清处理巨噬细胞的培养方法，应用流式分选对巨噬细胞分型，Real-time PCR方法检测处理后的巨噬细胞LXRs、IL10、IL12的mRNA表达水平，及通过干扰LXRs信号通路分析LXR受体与肿瘤相关巨噬细胞的形成及功能之间的关系。结果 发现肿瘤微环境可上调巨噬细胞LXRs受体在mRNA水平，并表现为M2型巨噬细胞的表型。结论 肿瘤微环境通过激活LXRs受体，诱导TAM的形成，从而促进肿瘤生长、转移及免疫逃逸。 【关键词】LXR受体 肿瘤相关巨噬细胞 免疫逃逸 【中图分类号】R73-3【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2013）03-0140-02 巨噬细胞根据活化状态和功能组要分为M1型和M2型。M1型巨噬细胞作为抗原提呈细胞参与细胞免疫和体液免疫，在抵御病原体的入侵，保护机体健康方面发挥着重要作用。然而，在多数恶性肿瘤中，发现具有M2型表型的巨噬细胞，即肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage TAM），作为肿瘤间质中的主要浸润细胞，TAM在肿瘤的发生、生长侵袭和转移过程中起着十分重要的作用[1]。肝X受体（liver X receptors,LXRs）为肝脏核受体，不仅参与机体代谢生理调节，还调节巨噬细胞介导炎症反应。人工合成的LXRs激动剂可以抑制炎症发生，该现象类似巨噬细胞M2型表型转变。因此，我们推测LXRs可能参与肿瘤组织中TAM形成，从而促进肿瘤生长、转移及免疫抑制效应。本文主要分析LXRs受体、TAM形成及肿瘤微环境间的作用关系，以了解肿瘤发生发展的新机制。 1 材料和方法 材料 雌性C57BL/6小鼠10只（SPF级，6～8周龄), 购自南京模式动物中心。TC-1、LLC和RAW264.7细胞系购自中科院细胞库。逆转录及Real-time PCR试剂盒购自Takara公司。 1.2 方法 1.2.1 小鼠肿瘤模型制备 雌性C57BL/6小鼠5只，皮下注射LLC肿瘤细胞3times;106/只,3周后，肿瘤直径约2cm，进行样本采集。 1.2.2 标本采集将处死的荷瘤小鼠，用5mlPBS腹腔灌洗，抽出灌洗液于4℃3000rpm离心6分钟，沉淀中细胞重悬，取1times;107细胞做Percp cy5.5—F4/80染色，流式分选F4/80阳性细胞，即PM细胞。在37摄氏度下用2mg/ml的胶原酶Ⅳ完全覆盖剪碎的肿瘤组织1小时，研磨组织后用1000rpm离心滤过的单细胞悬液6分钟，弃上清，加红细胞裂解液5ml，重悬细胞，6分钟后加PBS 45ml，1000rpm离心6分钟，弃上清，5ml PBS重悬细胞，计数细胞，取大约10times;107细胞加20ml含5%FBS的RPMI 1640培养基，培养1小时，此时肿瘤细胞处于悬浮而巨噬细胞贴壁，收集贴壁细胞，Percp cy5.5—F4/80染色，流式分选F4/80阳性细胞，即TAM细胞。另一部分肿瘤细胞，按照每10times;106的细胞，加1ml含10%FBS和1%青链双抗的RPMI 1640培养基，于细胞培养箱中培养24小时，收集上清备用。 1.2.3 Real-time PCR 检测mRNA表达水平 使用Trizol抽提PM和TAM的总RNA，逆转录生成cDNA，Real-time PCR 检测相关基因的mRNA表达水平。小鼠LXRalpha;上游引物：ATGATGCTGAGTTTGCTCTGC，下游引物：TATGTGTGTTGCAGCCTCTCT；IL10上游引物：CCAGT CGGCCAGAGCCACAT，下游引物： AAGGAGTCGGTTAGCAGTA；LXRbeta;上上游引物：GCAAGGACGACTTCCACCG，下游引物：GGCGATAAGC AAGGCATACTCT。 IL12上游引物：TGCCCTCCTAAACCACCT，下游引物：TCTGGCCGTCTTCACCATG。 1.2.4 ELISA检测细胞因子水平 IL10检测参照试剂盒说明书进行，通过标准品吸光度值绘制标准曲线，然后计算各样品IL10的水平。 1.2.5 统计学分析 实验结果以x-plusmn;s表示，采用统计学分析软件