酶联免疫吸附试验(双抗体法)检测实验犬斯氏肺吸虫循环抗原-四川动物.PDFVIP

酶联免疫吸附试验(双抗体法)检测 实验犬斯氏肺吸虫循环抗原的研究 刘纪伯 罗兴仁 刘常华 江梦雪 顾国庆 (四川省医学科学院寄生虫病防治研究所) 效都不理想。本文报告以家犬作为斯氏肺吸虫病实验动物模型，应用双抗体法，观察其体内 循环抗原的消长规律及治疗前后的变化，旨在探索解决临床上难于判定的药物疗效问题。 检 测 材 料 及 方 法 一、兔抗肺吸虫抗体的制备：用肺吸虫成虫抗原，免疫健康家兔获得的免疫血清(效价 1:12800)经硫酸铵提取，再经Sephadex—G200柱层析纯化，用自动收集仪收集，作对流免 疫电泳测定各管活性，混合浓缩以凯氏定氮测定，蛋白含量为2毫克／毫升，置4℃冰箱备 用。 二、酶标记抗体：取辣根过氧化物酶用戊二醛二步法标记兔抗肺吸虫抗体。试验时按 1:150稀释。 三、试验方法：用聚苯乙烯微量反应板以棋盘滴定，选择最佳条件进行检测。在反应板 上每孔加入经pH9.6碳酸盐缓冲液稀释的兔抗肺吸虫抗体(20微克／毫升)0.2毫升，于37℃ 温箱孵育6小时，然后放4℃冰箱过夜，次日倾去多余抗体，用0.05％Tween— 20生理盐水 洗涤3次，每次3分钟，加入待检血清0.2毫升，放37℃温箱2小时后倾去，如上洗涤三次， 加入酶标记抗体0.2毫升，放37℃温箱3小时后倾去，再洗涤三次，加OPD-HO 底物0.2 2 2 毫升，放37℃温箱保温20分钟，加2MH SO 50微升终止反应，测定每孔反应液的OD 2 4 492 值。 四、判断标准：将反应液作4倍稀释，于72型分光光度计读取OD 值。阳性和阴性的 492 临界点，以所有阴性标本OD值的均值加3个标准差，即OD≥0.26为阳性。每次试验均设阴 性和阳性犬参考血清作对照。 实 验 动 物 设 计 一、人工感染动物：高感染组20只犬，经腹腔注射斯氏肺吸虫囊蚴100个／只；低感染组 6只犬注射囊蚴30个／只，于感染后15天开始定期取血检测循环抗原。 二、治疗实验：8只犬于感染后三个月，用吡喹酮按240毫克／公斤／日×2日经口给药。 不服药对照犬12只(包括用于观察循环抗原OD值消长)。 三、交叉反应试验：用华支睾吸虫病实验犬血清9份，作交叉反应。 结 果 一、特异性试验： 低0.08)，均值加3个标准差为0.259，故本试验以OD值≥0.26为阳性。检测28份健康犬血 清全部阴性，检测肺吸虫病犬血清28份(其中高感染犬血清21份，低感染7份)全部为阳 性，阳性率100％，平均OD值高感染组为0.823±0.390，低感染组为0.642±0.373，两者无 25 显著差异(t=1.098)。 1:4为80％，1:8为56％，1:16为32％，1:32为12％，1:64为8％。 二、敏感性试验：取一定量循环抗原，加入由10份健康犬血清混合制成的标准阴性血 清，使循环抗原的含量为25微克／毫升，作倍比稀释，分别检测各稀释度的相应OD492值。 当循环抗原含量为0.09微克／毫升(OD值为0.26)时，曲线开始上升，2.9微克／毫升(OD 值1.30)时曲线变平，提示敏感范围约在0.09±2.9微克／毫升。 三、重现性试验：用0.277微克／毫升、10微克／毫升和25微克／毫升三种不同含量的循环 抗原阳性血清，进行重现性测验，每种含量进行三批，每批重复10次，试验结果变异系数均 低于10％，说明本实验的重复性较好。 四、实验犬循环抗原检出时间：感染后的实验犬，每隔