基因工程(基因工程的主要技术与原理-核苷酸序列分析).ppt

基 因 工 程;基因功能的研究是生命科学中的主要课题；;第四节 DNA核苷酸序列分析;基因测序方法;一、Maxam-Gilbert 化学降解法;将一个DNA片段的5‘端磷酸基作放射性标记；;G;1. 标记：将待测DNA片段的5‘端磷酸基作放射性标记；;G;Maxam-Gilbert化学降解法的测序长度大约为250个 碱基，适合G+C含量较高及较短的寡核苷酸片段的 测序；;操作繁琐；;二、双脱氧链终止法;5′-磷酸核苷酸的基本结构; ;;基于双脱氧核苷酸的这种特性，Sanger于 1977年建立了以双脱氧链终止反应为基础来 测定DNA序列的方法；;在DNA合成过程中，标记的*ddNTP将与相应的 dNTP竞争掺入到新合成的DNA互补链中。;H;ddATP;通过聚丙烯酰胺凝胶电 泳能分辨出小至一个碱基 长度差异的DNA片段,从 而将混合产物中不同长度 DNA片段分离开。;再通过放射自显影曝光, 根据片段尾部的双脱氧核 苷酸读出该DNA的碱基排列 顺序。;模板变性(dnature template)：将待测DNA模板与引物混合，通过加热使模板变性；;3′-G…CATNNNNNNNNNNNNNNN-5′;电泳方向;链终止反应的测序结果;链终止法和化学修饰法的缺点;三、DNA序列分析的自动化;基本原理;延伸中的DNA互补链分别终止于不同荧光标记的 ddATP、ddTTP、ddCTP、ddGTP，四种连终止反应 可在一个试管中进行，并在同一条泳道中检测。 ;ddA;序列结果：;ABI Prism DNA Sequencer 3130;使用毛细管凝胶电泳分离链终止反应产物， 可大大增加测序的通量，根据毛细管的数量的 不同，一台仪器可同时完成96个样品或更多样 品的分析。;问题：;1.通用引物指导未知序列的测定;2.引物步移测定大片段DNA核苷酸序列;四、DNA序列的信息分析;GenBank（美国）；;NCBI:（美国国家生物技术信息中心） ;;;;;; GmMYBZ2; GmMYBZ2空间结构预测 （CHPmodels-2.0服务器 ）;1.Maxam-Gilbert化学降解法测序的基本原理