基因工程第一章概述.ppt

4. 限制酶前面要带上R（Restriction)， 修饰酶前面要带上M（Modification）。（现已省略）。 2. 用一个右下标的大写字母表示菌株或型。如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如EcoR I）。 3. 如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。如EcoR I，EcoR V。 限制性核酸内切酶的命名 属名 种名 株名 H i n d III H i n d III Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株 同一菌株中所含的多个不同的限制性核酸内切酶 DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。 1. DNA的纯度 （四）影响限制性内切酶活性的因素 ① 纯化DNA ② 加大酶的用量 1 mg DNA 用 10 U 酶 ③ 延长反应时间 ④ 扩大反应体积（20?l） 一般采取 大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒： 2. DNA的甲基化程度 dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。 基因工程中必须使用甲基化酶失活突变的菌株。 大肠杆菌中的dam甲基化酶在5‘GATC3’序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、Mbo I等，但BamH I、 Bgl II、Sau3A I不受影响。 大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5‘CCAGG3’或5‘CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等。 哺乳动物中的甲基化酶在5‘CG3’序列中的C5位上引入甲基。 不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。 酶 最适 温度oC 酶 最适 温度oC 酶 最适 温度oC Apa I Bcl I Mae II Taq I 30 50 50 65 Apy I BstE II Mae III 30 60 55 Ban I Mae I Sma I 50 45 25 3. 温度 是影响限制酶活性的重要因素。 4. 缓冲液(Buffer) 缓冲液的化学组成 MgCl2、NaCl/KCl：提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl：维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定； 商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。 温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。 如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。 如高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，能切割与识别序列相似的序列。 所以一般使用专一的反应缓冲液。 星号（*）活性 4. 缓冲液(Buffer) EcoR I和BamH I等都有*活性。 在低盐、高pH（8）时可识别和切割 GAATTA、AAATTC、GAGTTC等 GAATTC EcoR I： 使用的时候要特别注意！ Eco R I 在正常条件下识别并切割5‘GAATTC3’序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5‘AATT3’或者5‘PuPuATPyPy3’。 使用的时候要特别注意！ （五）限制性内切酶对DNA的消化 1. 内切酶与识别序列的结合模式 1986年J.A. McClarin等通过X射线晶体衍射发现II类限制酶是以同型二聚体的形式与靶序列结合。 GAATTC CTTAAG 内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开。 2. 完全消化 1 2 3 4 1 2 3 4 只有有限数量的酶切位点被切开。 通过缩短保温时间、降低反应温度或减少酶的用量可达到局部消化的目的。 3. 局部消化 1 2 3 4 1 4 大多数酶可用65 oC温育5分钟失活。 或用乙醇沉淀DNA。 4. 限制酶酶切反应的终止 5. 几种常用限制酶识位点 （一） 功能： 保护宿主DNA不被相应的限制酶切割。 二、甲基化酶 在大肠杆菌中大多数都有如下位点特异的甲基化酶。 （二） 甲基化酶的种类 Dam甲基化酶 GATC，A-N6甲基腺嘌呤 BamHⅠ:GGATCC Dcm甲基化酶 CCAGG ，CCTGG, C-5甲基胞嘧啶 EcoRⅡ：CCAGG （三） 甲基化对限制酶切的影响 基