第三章 食品与蛋白质工程.ppt

第三章 食品与蛋白质工程;蛋白质的分子结构包括 一级结构(primary structure) 二级结构(secondary structure) 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure);定义 蛋白质的一级结构指多肽链中氨基酸的排列顺序。;一级结构是蛋白质空间构象和特异生物学功能的基础。;蛋白质的二级结构;1 肽单元;3 ?-折叠;4 ?-转角和无规卷曲;疏水键、离子键、氢键和 Van der Waals力等。 ; 肌红蛋白 (Mb) ;亚基之间的结合力主要是疏水作用，其次是氢键和离子键。;血红蛋白的四级结构 ; 第一节 概 述;一、蛋白质工程的涵义 定义：蛋白质工程是指以蛋白质的结构及其功能关系为基础，通过基因修饰、蛋白质修饰分子设计，对现存蛋白质加以改造，组建新型蛋白质的现代生物技术。 蛋白质的特点：①蛋白质的分子质量非常大②蛋白质的功能需要生理条件下发挥作用③蛋白质(酶)的专一性很强 蛋白质工程主要是通过化学、物理及酶学期对蛋白质进行加工、修饰，从而得到符合人类需要的功能特性的蛋白质。;二、理性分子设计和非理性分子设计 理性分子设计：在已知蛋白质三维结构与功能的基础上，利用专一改变基因中某个或某些特定核苷酸的序列，对一段最可能影响蛋白质功能与性质的基因序列进行定位突变，有目的地改变蛋白质的某一两个氨基酸残基或模块，从而构建全新的蛋白质分子。 非理性设计（定向进化）：是在不清楚蛋白质三维结构信息和作用机制的情况下，在实验室条件下模拟自然进化的过程(随机突变、重组和选择)，在一定条件下使基因发生大量变异，然后通过多轮高通量的筛选方法定向选择出所需要的特性突变物，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，得到具有特性预期的新蛋白质的一种蛋白质工程技术。;三、蛋白质工程在食品工业中的应用 天然酶制剂 优点： 高效、特异的催化活力 缺点： 分子质量很大，仅有一个活性中心，催化效率低； 对环境因素如温度、pH和重金属离子等比较敏感 ;分子修饰考虑的问题： ①改变亚基间静电相互作用强度； ②改变邻近残基间氢键数目； ③替换易被氧化和化学修饰的残基； ④减少蛋白质从伸展到折叠过程的自由能等。 改变酶的特性： ①提高稳定性 包括热稳定性、抗蛋白酶稳定性、抗氧化稳定性和有机溶剂稳定性等。 ②提高酶活力 酶活力中心及调控部位少数几个关键氨基酸残基在空间排列 ③改变酶的选择性 改变电荷分布，亲／疏水性及立体结构;;第二节 理性分子设计和 定位突变技术;一、蛋白质理性分子设计的基本步骤 (1)了解蛋白质的三维结构 查找PDB (2) 确定突变位点及替换的氨基酸 利用计算机模拟技术 (3) 预测修饰后的蛋白质结构 利用能量优化及蛋白质动力学方法;; 二、定位突变 定位突变是在已知蛋白质结构与功能的基础上，在已知DNA序列中取代、插入或删除特定的核苷酸，从而产生具有新性状的突变蛋白质(酶)分子的一种蛋白质工程技术。 目前常用的定位突变方法有： （一）寡核苷酸引物介导的定位突变 （二）重组PCR介导的定位突变 （三）盒式突变; 寡核苷酸引物介导的定位突变的原理是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。 ;寡核苷酸引物介导的定位突变;.将要改造的蛋白质的目的基因插入到M13单链DNA中; 寡核苷酸引物介导的定位突变法 优点 保真度比重组PCR突变法高 缺点 操作环节复杂、周期长 克隆待突变基因时会受到限制性酶切位点的限制 寡核苷酸引物介导的定位突变常产生突变效率低的现象;（二）聚合酶链式反应(PCR)介导的定位突变法;（三） PCR介导的定位突变法 优点：操作较简单，突变的成功率可达100％ 缺点： ①后续工作较复杂，PCR扩增产物通常需要连接到载体分子上，然后才能对突变的基因进行转录和转译； ②Taq DNA聚合酶的保真性偏低，因此PCR方法产生的DNA片段要经过核苷酸序列测定，方可确证有无发生其他突变。;（三）盒式突变技术;盒式突变法 优点： 简单易行、突变效率高 可以在一对限制酶切位点内一次突变多个位点 缺点： 合成多条引物的成本较高;三、定位突变技术在酶结构改造中的应用 (一)淀粉酶 利用蛋白质工程提高各种淀粉酶的热稳定性 (二)蛋白酶 增加酶活力，增强抗氧化性 (三)脂肪酶 提高酶稳定性 (四)纤维素酶及木聚糖酶 提高热稳定性;第三节 体外定向进化; 一、蛋白质的体外定向进化 蛋白质的体外定向进化又称分子进化，就是在实验室条件下模拟自然进化机制，对编码蛋白质的基因进行随机诱变、重组，再通过高通