基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法检测罕见单糖合成酶.pdfVIP

研究简报 第l期 第41卷 分析化学(FENxI刖A)(I甩) Jo啪a1of 115～118 2013年1月 Chillese AnalyticalChemis缸y 基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法检测罕见单糖合成酶 周大炜¨’23 刘斌1’2’3 吴俊丽1’2’3 齐源远1 1(南开大学泰达生物技术学院，天津300457) 2(天津市微生物功能基因组学重点实验室，天津300457) 3(南开大学分子微生物学与技术教育部重点实验室，天津300457) 摘要以vioF(普罗威登斯菌030中0抗原基因簇内)编码的甲酰基转移酶酶促反应产物为研究对象，采 用碰撞诱导解离(cID)负离子模式基质辅助激光解吸电离一飞行时间质谱(MALDI—TOFMs)技术建立简 单、高效的罕见单糖合成酶监测方法。本方法首先直接质谱分析03灿未经色谱分离、除盐处理的酶促反应 混合物，随后应用cID串联质谱技术对酶活反应产物进行结构表征，实现酶活反应的快速监测。结果表明： 高能cIDMALDI—TOF厂r0F—Ms平台适用于新建克隆的单糖合成酶酶活反应的监测，与现有的监测方法相比． 在速度、灵敏度、重现性、自动化和溶剂消耗方面具有绝对优势。 关键词罕见单糖；单糖合成酶；基质辅助激光解吸离子化一飞行时间质谱 1 引 言 随着越来越多的细菌表面多糖抗原的结构得到鉴定，被发现的罕见单糖成分逐渐增多，表明罕见单 糖在O抗原多样性的形成中占有非常重要的地位。如￡一鼠李糖对于某些细菌的毒性是必须的，该合成 路径并未在人类中发现。由于含有罕见单糖的抗原结构更容易逃避宿主细胞的免疫识别，因此在细菌 尤其是致病菌的形成和进化过程中，罕见单糖起着非常关键的作用。通过对0抗原中罕见单糖合成酶 基因的研究，将增加对0抗原多样性及其形成和进化机理的了解。 基质辅助激光解吸电离一飞行时间质谱(MALDI．TOFMS)可测定完整的罕见单糖分子质量，同时 还可以应用碰撞诱导解离(cID)技术获得罕见核苷糖的骨架等信息。特别是MAI，DI—TOFMs技术已 成功用于多种酶的活性监测。因此，结合已知罕见核苷糖生化合成途径的专业知识，可以胜任罕见单糖 合成酶酶活的监测和初步表征工作。本研究以本实验室前期应用核磁共振(m佃)技术已证明其基因 功能的vioF编码的转甲酰基酶酶促反应产物为研究对象(示意图1)”l，采用MALDI．TOFMs技术监 测酶活产物的生成，并在进一步应用高能cID 进行表征的基础上，建立了简单、高效、灵敏和准确的罕见单糖合成酶活性监测方法。本研究为酶法合 成罕见单糖奠定了基础。 2 实验部分 2．1仪器与试剂 MAI，DI．TOF MS基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(4700Biosystems，MA)。甲醇、 Applied P)，脱氧胸苷三磷酸(dTTP)，5一磷酸吡哆醛(PLP)，无机焦磷酸脂酶(Ino唱锄ic 因、删基因和普罗威登斯菌030抗原中ⅥoF基因的克隆、含相应重组质粒的细菌培养及上述4个表 达产物的纯化制备等按文献[1]方法进行。实验用水为二次蒸馏水。 2012_04_22收稿；2012-08—16接受 本文系南开大学引进人才科研启动资金(No．J02006)资助 +E—mail：dawei商ou@nanl(ai．edu．cn 116 分析化学 第4l卷 “蕊哥豢Ⅲ怼爵；鬻爵 n豳。霉“c啜善甄 +D尝基船譬酸盐 …f-磷籼．葡萄梏 ㈣懈酸-D-6-脱彻．木¨∑兰吡啶静 ‘ 7∞ke而