基质辅助激光解吸电离质谱法研究海兔卵多肽内切酶组成、结构与功能.pdfVIP

第35卷 分析化学(FENxIHuAXuE)研究报告 第8期 Cllinese of 1105一】110 2007年8月 Joumal Analytic；llChemjs时 基质辅助激光解吸／电离质谱法研究 海兔卵多肽内切酶组成、结构与功能 黄河清“’2，3 陆永进1 林庆梅1·3 卓慧钦1 黄慧英1 (厦门大学生命科学学院细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室1； 化学化工学院物理化学固体表面国家重点实验室2； 海洋与环境学院近海海洋环境科学国家重点实验室3；厦门361005) G．150为分离介质，采用柱层析法分离纯化海兔卵多肽酶(En． 摘要选择DEAE一52纤维素和sephadex d叩eptide踮e 和亚基分子量(约39 成，其zA比值分别为1273817、18108 42 量为38221 力，其酶切产物m儿比值为1“951、208584、4080．41和416542。白行设计INs序列分析软件，鉴定AEE。 可以发生酶切。通过INs和海兔吸引素的分子结构比对后，指出海兔卵中的AEE。主要功能之一是负责酶切 海兔吸B『素，起着海兔之问信息交往、召唤、识别和交配的重要作用，AEE，。具有酶切酸性多肽(acidicPeP— ti山，AP)中ku—ku的能力，属于一种广谱性多肽内切酶。 关键词海兔，多肽陡切酶．质谱分析，吸引索，胰岛素 1 引 言 海兔属于腹足纲软体动物，它是开展神经结构生物学研究的重要模式生物之一。海兔是雌雄同体 类动物，通常以独立食宿方式生活，只有在产卵受精期间，才聚集成群。吸引素来源于海兔卵腺(egg 构类似人胰岛素，均具有三对链内二硫键。部分吸引素合成后有接释放到海水中，并作为海兔之间的信 息传递与交流媒介”3。。研究吸引素结构与功能和如何识别海永中超微量吸引素及酶切片段均具有重 要的生物学意义，拟开展相关研究工作的关键技术之一，在于建立的最佳分析技术。 目前已从海兔卵带中分离出4种吸引素酶切片段，其分子序列分别从吸引素的N端到c端的 多肽内切酶。近年来有关吸引素的组成、结构和功能已进行较为详细地研究”“1，但有关吸引素多肽酶 和酶切吸引索的途径和机理尚未见报道。其主要原因是至今尚未发现吸引素多肽酶，并供结构与功能 研究。本研究采用生物工程下游技术分离纯化AEE。选用类似吸引素结构的INs为探针，采用MAL 在海兔之间信息交往、召唤、识别和交配以及对理解动物本能起到至关重要的作用。 2实验部分 2．1材料、试剂与仪器 G-150(Phar一 2006—07-10收稿；2007旬2_05接受 和厦门大学科研基金(No 本文系国家自然科学基金(No 2004xdcx207，xdqc资助项月 educn 十lC_m枷l：hqhuaⅡg@xmu 1106 分析化学 第35卷 据吸引素和rNs分子结构特殊性和相似性，门行设计分析软件鉴定INs和吸引素的酶四位点。 2．2 AEP。的分离纯化实验 取50 g海兔卵于含有25．O 000 进行人工捣碎10min。随后离心30min(6g，4℃)，收集上清液，并用真空冻干法将上清液冻成十 mm×200 粉。取适量干粉，溶于Tris_Hcl缓冲液，得粗酶液。选用离子交换柱