基质辅助激光解吸附电离-飞行时间串联质谱研究重组人促红细胞生成素一级结构.pdfVIP

第34 卷 分析化学 （FENX HUAXUE ） 研究报告 第5 期 2006 年5 月 Chinese JOurnaI Of AnaIyticaI Chemistry 59l ~ 597 ””””””” ” ” 研 究报 告 ” ” ””””””” 基质辅助激光解吸附电离-飞行时间串联质谱 研究重组人促红细胞生成素一级结构 l 2 l l l l 卢 庄 王 杉 代景泉 王京兰 张养军 应万涛 2 l 2 l 徐友宣 钱小红 吴侔天 蔡耘” l （军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京l00850 ） 2 （国家体育总局运动医学研究所兴奋剂检测中心，北京l00029 ） 摘 要 建立了生物质谱研究rhEPO 一级结构的系列方法，包括分子量、唾液酸含量以及!-糖含量等糖基化 性质的测定方法，并用于4 种国产rhEPO 样品的分析；在此基础上优化酶切条件，使测定的肽质量指纹谱 （PMF ）的覆盖率均达到98% ，成功鉴定了4 个样品中的全部!-糖基化位点以及对分子中两对二硫键进行了 结构确证，测定4 个样品分子量分别为：27754 . l 1 27 . 4Da 、2794 l. 4 1 23. 2 Da 、27682 . 5 1 22 . 0 Da 和279l4 . 7 1 22 . 5 Da ；唾液酸含量分别为：5. 0% 、4 . 8% 、5. 6% 和5. 4 % ；糖含量分别为：34 . 3% 、34 . 7% 、34 . l% 和 34. 6% 。此外还对4 种产品在-连接糖型及!-连接糖型上的区别做了初步探讨。 关键词 基质辅助激光解吸附电离-飞行时间串联质谱，重组人促红细胞生成素，肽质量指纹谱，二硫键，!-连 接糖基化位点，糖型结构 ! 引 言 促红细胞生成素（EPO ）是一种糖蛋白，绝大部分由肾脏产生，少量来自肝脏（胎儿及新生儿则主要 ［l］ 由肝脏产生） 。其最主要的功能是促进红细胞的生成，提高机体血红蛋白的浓度，临床上主要用于治 疗肾性贫血和一些并发性贫血。l988 年出现了与天然EPO 活性几乎相同的重组EPO（rhEPO ）产品，它 能够改善机体携氧能力，增强人体耐力，因此，很快就成为一种应用广泛的生物工程药物。有些运动员 将其作为兴奋剂使用。研究表明，EPO !-糖基化程度对EPO 的体内活性有相当大的影响。!-糖基化 不完全的rhEPO 体外活性正常，而体内活性则降低到体外活性的l/ 500 ，其体内被清除的速率也明显 ［2 ］ 降低 。EPO 属于内源性物质，正常人体液中含量很低，半衰期短。rhEPO 与内源性EPO 的氨基酸序 ［3 ］ 列完全相同，仅糖基部分有微小的差别 。rhEPO 比天然EPO 含有更多的三天线及四天线低聚糖，并 且二者在唾液酸化程度上有明显的差别［4 ，5 ］。由于rhEPO 糖基化性质与rhEPO 的生物学功能关系密 切，且是内源性EPO 与外源性EPO 的区别所在，因此，作为生物工程药物的rhEPO 其一级结构的确证， 具有重要意义。 本研究应用生物质谱对4 种 国产rhEPO 进行了一级结构分析，建立了一系列生物质谱研究rhEPO 多种