基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法区分大肠杆菌糖基转移酶基因.pdfVIP

第39卷 分析化学(FENxI删AxuE)研究简报 第1期 ChineseJo哪alof 99～102 2011年1月 Anal”icalChemistry 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法区分 大肠杆菌糖基转移酶基因 周大炜叫∞ 刘斌1∞ 吴俊丽1，2’3 胡波1 齐源远1 (南开大学泰达生物技术学院1，天津市微生物功能基因组学重点实验室2， 南开大学分子微生物学与技术教育部重点实验室3，天津300457) 摘要采用高能碰撞诱导解离(cID)一负离子模式基质辅助激光解吸离子化一飞行时间质谱技术(MALDI TOF O抗原基因簇内)编码的rl，3一甘露糖转移酶酶促反应产物一两个脂寡糖非对应异构体。结果表明：由高能 cIpMALDI TOF质谱图中产物离子【B，】／【Y，】丰度比率的差别可明确区别两个酶促反应产物。并发现碰撞能 量为1．O kV时，碰撞靶气的压力变化可影响产物离子[B，】／Ⅳ，】的丰度比率。推断MALDI—TOF质谱图中，两个 脂寡糖非对应异构体的磷酸二脂键部分和糖苷键的裂解依赖于糖基给予体的立体化学。 关键词脂寡糖；糖基转移酶；基质辅助激光解吸离子化一飞行时间质谱 1 引 言 O抗原是革兰氏阴性菌外膜的重要成分，也是免疫系统和抗菌素的主要靶点，O抗原的多样性对于 细菌的致病性及在宿主体内的生存有重要作用…。O抗原由寡糖重复单位组成，每个重复单位通常由 2～8个单糖组成，◇抗原的多样性主要源于构成重复单位的单糖种类和糖苷键链接方式的不同。在 0一抗原生物合成过程中，糖基转移酶负责将核苷二磷酸单糖前体上的糖基转移到延伸中的寡糖单位。 尽管糖基转移酶非常重要，但由于编码此类酶的基因之间的同源性很小，根据与其它已知基因的比 较，只能判断一个未知基因是否属于这类基因，不能判断其合成的糖苷键类别。目前，糖基转移酶基因 功能的明确鉴定主要依赖酶促反应产物化学结构的正确表征。大部分糖基转移酶酶促反应产物属于脂 寡糖非对映异构体，由于脂寡糖非对映异构体鉴定和区分的困难，在纯化制备酶促反应产物的基础上， 应用核磁共振(NMR)技术仅能明确鉴定少部分假定糖基转移酶的特定功能哺叭。 理论上，一维和二维NMR技术是现有测定糖链结构最常用的方法，也是区分脂寡糖非对映异构体 的最有效途径。但其主要缺点是灵敏度较低，特别是涉及耗时繁琐的分离纯化制备步骤。近年来。基质 辅助激光解吸离子化方式的发展和成熟为寡糖非对映异构体的区分提供了技术平台…1。本研究在采 用NMR技术已证明其基因功能的基础上，以噼D编码的卢L1，3一葡萄糖转移酶和哟D编码的a—l，3一甘 露糖转移酶酶促反应产物——两个脂寡糖非对应异构体为研究对象，采用高能碰撞诱导解离(cID)一负 离子模式基质辅助激光解吸离子化一飞行时间质谱技术(MALDI—TOF—Ms)，对两个脂寡糖非对映异构体 进行了区分。 2 实验部分 2．1仪器与试剂 MALDI—TOF—Ms基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪(4700 Applied Aldrich公司)，水为二次蒸馏水。本实验涉及的菌株、质粒、酶及其它生化试剂参见文献[2】。 20lm04-28收稿；20lo-11一07接受 本文系南开大学引进人才科研启动资金(No．J02006)资助 ‘E_mail：血wei曲0u@n姐l【ai．edu．cn lOO 分析化学 第39卷 2．2样品制备 大肠杆菌077抗原中哟D基因和0152抗原中孵D基因的克隆、含重组质粒的细菌培养及酶活 反应细胞膜提取物的制备按文献[2]方法进行。由于哟D和啦D与细胞膜之间存在相互作用，本研究 以H1517(含啦D或鸣D基因的重组质粒)的细胞膜部分作为酶的来源进行酶促反应。