第3章 细胞生物学的研究方法1(显微镜技术).pptVIP

高尔基体的TEM照片 电镜三维重建技术 扫描电镜 成像原理 阴极钨丝加热后产生的电子束经过栅极和阳极加速和会聚，再经二级聚光镜及物镜会聚形成具有一定能量、一定束流强度和束斑直径的微细电子束； 电子束在扫描线圈驱动下，在试样表面按一定时间、空间顺序作栅网式扫描。聚焦电子束与试样相互作用，产生二次电子发射。二次电子发射量随试样表面形貌而变化； 二次电子信号被收集、转换、放大，在电视荧光屏上同步扫描成像。 扫描电镜的成像原理 人类血细胞SEM照片 扫描电镜的特点 高的分辨率 很强的立体感 放大倍率范围广 样 品 适 应 性 大 应用范围广 描隧道显微镜（scanning tunneling microscope，STM） 由Binnig等1981年发明，是根据量子力学原理中的隧道效应而设计制造的。当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV-2V），针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。电流强度和针尖与样品间的距离有一指数关系。 扫描隧道显微镜 当探针沿物质表面按给定高度扫描时，因样品表面原子凹凸不平，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向为0.1-0.2nm，纵向可达0.001nm。它的优点是三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察，而普通电镜只能观察制作好的固体标本。 利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。 以Z字形移动 X和Y向扫描 通过连续的扫描形成的像 要成像的表面 扫描针尖 复习题 名词解释：分辨率；显微结构；超微结构 2. 简述荧光显微镜的原理与应用特点。 3. 简述相差显微镜的工作原理。 ??? 在光学显微镜中,照明系统是可见光,使用的是玻璃透镜,可直接通过目镜观察镜像.在电子显微镜中,照明系统为电子束,是用电磁透镜通过荧光屏观察样品的镜像. 尽管这两类显微镜的照明系统和装置的设计不同,但是他们所依据的原理相同,成像方式相似.当样品被放置在光或电子束的通路中,光束或电子束被改变的物理特征能够用肉眼观察或被显像板记录下来. * * ⑴一组滤光片：激发滤片和吸收滤片。⑵双色镜。 * * 荧光物质 1. 自发荧光 某些天然物质本身能发出荧光，如叶绿素。 2. 二次荧光 ?? 非荧光性物质用荧光色素染色后，可产生荧光（二次荧 光），以便于进行观察 。 3. 抗体荧光技术 ?? 带荧光标记的抗体与标本中的抗原结合，这样就能通过 抗体结合的荧光观察到抗原。 4. 绿色荧光蛋白（GFP） 图示： 鼠主动脉 平滑肌细胞的 荧光染色。 核:blue 线粒体:green 肌动蛋白:red 经专一性的荧光染料染色后，在荧光显微镜下看到的正在分裂的细胞 绿色：DNA的染色 红色：纺锤体的一种微管蛋白 免疫荧光显微镜技术 ⑴原理: 荧光抗体与标本切片中组织或细胞的抗原进行反 应，在荧光显微镜下可观察到明亮的特异荧光。 ⑵荧光素标记抗体的方法 ①直接法：荧光素直接和第一抗体偶联。 ②间接法：荧光素先和第二抗体(抗第一抗体的抗 体)偶联，再与第一抗体作用。 荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） 蓝色为细胞核，绿色为微管 绿色荧光蛋白(GFP) ⑴发光原理: 蓝色光 GFP 绿色荧光 ⑵特点: 可在光镜水平，对特异蛋白质等生物大分子进行定 位及显示一些细胞超微结构。 ⑶应用: 特异蛋白质等大分子的定位。 荧光显微镜观察绿色荧光蛋白 载体(GFP基因＋待定位蛋白基因) 导入特定的细胞 荧光显微镜下观察 待定蛋白质在细胞内的位置分布 特异蛋白质生物大分子定位 暗视野显微镜 在日常生活中，室内飞扬的微粒尘土是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束从光线从门缝斜射过来，灰尘便粒粒可见了，这是光学上的丁达尔现象。 ——制造暗视野显微镜的灵感 原理: 利用特殊装置使照射光斜照到样品上，照射光无法进入物镜，故呈暗视野。只有从样品发出的散射光才能进入物镜被放大,在暗的背景中呈现明亮的像。 分辨率： 典型的动物细胞 —