第3章 细胞生物学的研究方法2(其他技术).pptVIP

C.亲和层析 D.疏水性层析 亲和 疏水性 基质＋抗体 基质＋疏水基团 高压液相层析 (HPLC） 基质粒度小 分辨率高 分离速度快 电泳 原理 氨基酸带有正、负电荷，因此蛋白质往往带有净正电荷或负电荷。将含有蛋白质的溶液加上电场，蛋白质分子就会按照它们的净电荷的多少、大小及形状的不同在电场中移动，这一技术称为电泳。 大小 电荷 形状 SDS：根据蛋白质分子量、亚单位组成 * 样品处理: SDS(十二烷基硫酸钠) 2- 巯基乙醇(2-ME)/二硫苏糖醇(DTT) * 支持体: 单体丙稀酰胺 聚丙烯酰胺凝胶 * 染 色: 考马斯亮蓝 特异性蛋白 (western blotting) √ 将经聚丙稀酰胺凝胶分离的蛋白带转移至硝酸纤维素膜,然后将膜与特异性抗体作用,膜上特定蛋白条带将与抗体结合,并进一步与酶标记二抗反应,最终以发色底物显色而被检测. 基本步骤: (1)SDS(2)转膜 (3)抗体反应 一抗孵育 标记二抗孵育 (4)显色 Western 印迹技术 等电聚焦电泳 双向电泳—蛋白质分子量、等电点 质谱技术 原理：通过测定样品离子的质/荷比来进行成分和结构分析的方法。 应用：蛋白质鉴定 （2002年诺贝尔化学奖获得者） 放射自显影术 (autoradiography) 将放射性前体物质掺入细胞，使放射性分子和细胞内原有的未标记分子混和，因它们的化学性质相同,细胞就会不加分辨地利用。 同位素示踪技术  ●放射性化合物渗入活细胞 ●培养后取样、固定,进行光镜或电镜切片 ●在暗处把感光乳胶覆盖于切片上，存放在暗处 ●在此期间,放射性同位素衰变使乳胶曝光后显影及定影。根据银粒所在部位，就可知道细胞中放射性物质的分布。 具体操作过程 A.细胞内生物大分子的定性、定位与半定量 蛋白质——放射性同位素标记的氨基酸 核 酸——放射性同位素标记的碱基 B.示踪细胞中几乎所有的过程 对放射性分子在细胞内存在部位和化学形式进行追踪，就可测定放射性分子进入细胞后不同时间所在的位置和化学变化（光合作用）。 分泌蛋白在细胞内定位 ① 将胰岛β细胞与3H-亮氨酸共同孵育5分钟， ② 用未标记的亮氨酸冲洗。 ③ 在暗处把感光乳胶覆盖在切片上存放数日。 ④ 放射性同位素衰变使乳胶感光，经过显影和定影，根据感光乳胶黑色银颗粒所在位置即可知道细胞中放射物质的分布情况。 分泌蛋白在细胞内合成、运输及分泌 抗体示踪技术 A. 抗体 + 荧光素 B. 抗体 + 胶体金 C. ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 抗体＋酶 酶 酶 底物 显色 聚合酶链式反应—克隆DNA片断(polymerase chain reaction，PCR) （1）反应体系： 模板链 DNA 聚合酶 dNTP 引物 （primer） （2）反应步骤： 变性 95℃ 退火 45℃～65℃ 延伸 72℃ 核酸电泳 复习题 名词解释：细胞培养；原代培养；亲和层析；沉降系数 2. 简述流式细胞技术的原理并举例说明应用特点。 3. 设计提取小鼠体内某种细胞。??? * * 由于不明原因，人与鼠细胞融合产生的杂种细胞中会随机丢失染色体，每种杂种细胞仅含有一条或少数几条人染色体。通过对杂种细胞系的分析，就可以了解某一染色体的特殊功能。如仅含有1号染色体的杂种细胞才能合成人尿苷单磷酸激酶，就证明了编码这一酶的基因存在于1号染色体上。 * * * 过程 * 动画 * LOGO 细胞分离 (1) 制备单一细胞悬液 组织 EDTA 细胞间连接 消化 胰酶 细胞外基质 多细胞悬液 分离不同类型细胞 A. 离心 （centrifugation） 大小