毕业论文-磁性复合微粒在mRNA纯化中的应用.docVIP

磁性复合微粒在mRNA纯化中的应用 2014年 5 月 摘 要 磁性复合微粒是由高分子或无机材料与磁性超细粉末（如铁的氧化物、铁、钴、镍等金属）构成的具有超顺磁性的胶态材料。磁性复合微粒可在外加磁场中被快速分离，反复操作无磁记忆性。此外，通过物理吸附或其表面功能基团（如羧基、羟基、氨基等）的作用，可将抗体、酶、核酸、小分子探针及药物等分子固定在其表面。基于磁性复合微粒的超顺磁性以及表面生物分子可修饰的特点，磁性复合微粒已被广泛用于细胞学、免疫学、分子生物学、临床诊断与治疗等研究领域。 生物样品中mRNA的分离纯化是分子生物学研究的前提和关键环节。以磁性复合微粒为载体的mRNA纯化方法高效、快捷，获得的mRNA分子完整。国外已有相关产品，但售价昂贵，难以普及，国内在此方面的研究与开发还较为落后。本研究以不同组成的微米级磁性复合微粒为材料，将oligo(dT)通过共价作用或链亲和素-生物素的相互作用固定在磁性复合微粒的表面，并以此为载体开展了从不同动、植物组织中纯化mRNA的研究。 将表面硅烷化含氨基末端的磁性Fe3O4微粒以苯二异硫氰酸酯活化，进而将氨基标记的oligo(dT)20共价偶联在其表面，并系统开展了从不同动、植物组织总RNA中提取mRNA的研究。结果表明：1 mg磁性复合微粒可偶联氨基标记oligo(dT)20 的量在 0.85 nmol~0.9 nmol之间。从100 μg大鼠肝脏、肾脏、脾脏总RNA中可分别提取得到2.26 μg、2.45 μg、1.77 μg的mRNA；从100 μg苜蓿草、小叶女贞的总RNA中可分别提取得到 0.93 μg、1.58 μg的mRNA。得到的mRNA在260 nm 和280 nm的吸光度值的比值（OD260/OD280）在1.8~2.0之间，表明mRNA具有较高的纯度。琼脂糖凝胶电泳结果显示，mRNA 呈清晰慧尾片状条带。以大鼠肝中提取的mRNA为模板，对β-actin基因的逆转录-聚合酶链式反应可得到分子量为240 bp 的目的DNA片段。表明纯化的mRNA分子完整，提取过程中未降解。对表面偶联有oligo(dT)20的磁性复合微粒进行6个月的跟踪实验，数据显示，磁性复合微粒可高效稳定地用于mRNA分离纯化。 本研究还开展了以偶联有oligo(dT)20的氨基末端硅烷化磁性复合微粒直接从动物组织中提取mRNA的初步研究。此外，通过链亲和素-生物素系统将oligo(dT)25固定在金磁微粒表面，对总RNA中提取mRNA的条件进行了探索，并得到了初步的结果。 关键词： 磁性复合微粒 oligo(dT)20 mRNA 纯化 Abstract Superparamagnetic composite particles are composed of ferrofluid (such as iron oxide, Fe, Co, Ni nanoparticles) and inorganic/organic materials. Antibodies, enzymes, nucleic acids/oligonucleotides, molecular probes or medicine can be immobilized on magnetic particle surface by physical adsorption or covalently interaction between the functional groups (such as amino, carboxyl, thiol) on magnetic particles and biomolecules. Based on the advantages of magnetic separation and the immobilization of biomolecules, magnetic composite particles have been widely applied in the field of cell sorting, enzyme immobilization, immunossay, drug delivery and biomolecule purification. mRNA plays an important role in gene analysis, coupled with oligo(dT)20, magnetic particles have been proved as a ideal carrier in purification of mRNA. The method has advantages such as rapid perfo