高级生化 第二章 基因研究技术2(测序).ppt

一）杂交测序技术 原理 将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上， 每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置。待检测的DNA分子与芯片温浴，凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号，然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装拼接成完全的DNA顺序。 优点：检测速度快，成本低。 缺点：误差较大，不能重复测定。 利用基因芯片进行杂交测序的原理 目标序列 CGTGACT 互补序列 GCACTGA 探针 4碱基 杂交结果 GCAC CACT ACTG CTGA 重构目标序列的互补序列GCACTGA 目标序列 CGTGACT 。 杂交测序举例 二）Solexa测序技术 Illumina公司发明。 2008年，《Nature》杂志上一连出现三个人类基因组图谱：炎黄一号-第一个亚洲人图谱；第一个癌症病人图谱；第一个非洲人图谱。它们全是用Illumina公司依据Solexa测序技术完成的。 Incorporation → Scan → Cleavage Solexa测序技术的特点 ①通量高。目前一台机器在两周内最高可产出360G 的数据; ②准确率高。≥98. 5% ，同时也有效地解决了多聚重复序列的读取问题; ③成本低。低于传统Sanger 测序技术成本的1% ; ④DNA 序列的读取长度不断增加，当前单条序列读长可达到150 bp。 ⑤需要样品量少。Genome Analyzer系统需要的样品量低至100ng，这是很多研究人员所考虑的因素。 ⑥可以进行Pair-end( PE) 双向测序，PE 文库插入片段大小范围可由150 bp 到10 kb。 454公司发明。早在2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，被《Nature》杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序（sequencing-by-synthesis）的先河。 之后，他们又推出了性能更优的第二代基因组测序系统—— Genome Sequencer FLX System (GS FLX)。 三） GS FLX测序技术 GS FLX测序技术原理 1）样品片段化： GS FLX系统支持各种不同来源的样品，包括基因组DNA、PCR产物、BAC、cDNA、小分子RNA等等。大的样品例如基因组DNA或者BAC等被打断成300－800 bp的片段；对于小分子的非编码RNA或者PCR扩增产物，这一步则不需要。 2）文库制备：借助一系列标准的分子生物学技术，将A和B接头（3’和5’端具有特异性）连接到DNA片段上。接头也将用于后续的纯化，扩增和测序步骤。具有A、B接头的单链DNA片段组成了样品文库。 3）制备DNA磁珠：单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上。每一个磁珠携带了一个独特的单链DNA片段。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，这样就形成了只包含一个磁珠和一个独特片段的微反应器。 4）乳液PCR扩增：每个独特的片段在自己的微反应器里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。对于每一个片段而言，扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增的片段仍然结合在磁珠上。 测序原理 5）芯片制备：经乳液PCR法扩增后携带有大量模板的磁珠被放置到芯片(PTP)上的微孔中。PTP孔的直径(29um)只能容纳一个磁珠(20um)。然后将PTP板放置在GS FLX测序仪中，测序开始。 6）在微孔中加入反应液：酶混合物（包括DNA Polymerase、ATP Sulfurylase、Luciferase和Apyrase）和底物混合物（包括APS(腺苷酰硫酸)和Luciferin(荧光素)）。 7）测序PCR：放置在四个单独的试剂瓶里的四种碱基，依照T、A、C、G的顺序依次循环进入PTP板孔内，每次只进入一种碱基。如果发生碱基配对，就会释放一个焦磷酸。同时反应体系中剩余的dNTP在腺苷二磷酸酶的作用下发生降解。 8）信号检测：释放的焦磷酸经过一些列反应最终释放出光信号，此光信号实时被高灵敏度CCD捕获到。有一个碱基和测序模板进行配对，就会捕获到一分子的光信号；由此一一对应，就可以准确、快速地确定待测模板的碱基序列。 A：液体试剂供应装置 B：反应池芯片 C：信号检测系统 焦磷酸法测序 焦磷酸测序，也称光点测序（pyrosequencing) 荧光素酶 ATP硫酸化酶 荧光素 氧化荧光素 可见光 454测序技术的特点 ①速度快 一个测序反应耗时10 h，获得4 － 6 亿个碱基对。比传统的Sanger 测序的