分子生物学课件分子杂交.pptVIP

第八章 聚合酶链反应 1985年PE-cetus公司的人类遗传研究室Mullis等人发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)。此技术能够特异地扩增任何所希望的目的基因或DNA片段。在基础和临床医学、法医、考古等方面有重要的应用价值，并对分子生物学技术的发展给予巨大的推动。 ;第一节 PCR原理与特点 第二节 PCR类型 第三节 PCR技术在医学上的应用 ; 一、PCR的基本原理 在试管中给DNA的体外合成提供一种合适条件——模板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲液系统和DNA变性、复性及延伸的温度与时间等，使目的DNA得以迅速扩增(图8-1)。 ;㈠ DNA模板变性 双链DNA是通过94℃左右的高温使其发生变性，形成单链DNA。 ㈡ 模板与引物退火 将合成的两个寡核苷酸引物分别与待扩增DNA两端的序列互补。通过控制退火条件，引物就能准确地与扩增区域的两端配对。 ㈢ 引物延伸 在4种dNTP底物及Mg2+存在条件下，DNA聚合酶在最适作用温度可将单核苷酸从引物3′端掺入，沿模板延伸合成新股DNA，每一循环的产物可作为下一循环的模板。; 以上所述的变性、退火、延伸“三步曲”被确定为PCR的一轮循环，整个PCR过程一般需进行三十轮的循环。 按2n的指数方式递增， PCR扩增量应达到230个拷贝， “平台效应”出现的迟早主要取决于起始模板的拷贝数、所用的DNA聚合酶的性能及底物dNTP的浓度等多种因素。 ; 二、PCR技术的特点 ㈠ 高度的敏感性 PCR产物的生成是以指数方式增加的，即使按75%的扩增效率计算，单拷贝基因经25次循环后，其基因拷贝数也在100万以上，即可将极微量(pg级)DNA扩增到紫外光下可见的水平(?g级)。 ㈡ 高度的特异性 PCR扩增的特异性在很大程度上依赖于引物与模板的互补程度，即引物与模板结合的正确性。 ㈢ 操作简便、快速 ㈣ 适用样品广泛 含微量(pg、ng)目的DNA或RNA的样品即可用作反应的起始材料。 ;(5) 二个引物之间不应有互补序列，以免形成“引物二聚体”，浪费引物。 (6)?引物5′末端碱基无严格限制，在与模板结合的引物长度足够的条件下，其5′端碱基互补程度无严格限制。 (7)?? 引物3′端的头1~2个碱基会影响Taq DNA聚合酶的延伸效率，从而影响PCR反应的扩增效率及特异性，因此选择合适的3′端碱基很重要。最好选T、C、G，不选A (8)?引物的3′端应为保守氨基酸序列，即采用简并密码少的氨基酸如Met、Trp，且要避免三联体密码第3个碱基的摆动位置位于引物的3′末端。 ;㈢ 耐热DNA聚合酶 Taq DNA酶有良好的热稳定性，Taq DNA聚合酶在70~75℃时具有最高的生物学活性。 ㈣ 脱氧核苷三磷酸 脱氧核苷三磷酸(dNTP)是dATP、dCTP、dGTP和dTTP的总称，是靶DNA序列扩增的原料。dNTP浓度取决于扩增片段的长度、MgCl2浓度、引物浓度等反应条件。 ㈤ 缓冲液 目前最为常用的缓冲液体系为10~50mmol/L Tris-HCl (pH 8.3~8.8,20℃)。 ㈥ Mg2+ Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+浓度过高则影响PCR反应的特异性。;㈦ 添加剂 PCR反应中加入一定浓度的添加剂如DMSO (二甲基亚砜)等可提高PCR扩增效率及特异性 ㈧ PCR循环数 30次是比较合理的循环次数，循环次数太少，产物的量不多；循环次数过多，则非特异性产物增加。 ㈨ PCR易发生的问题及解决方法 ⒈没有得到所希望的PCR产物(假阴性) ⒉所有样品均为阳性(假阳性) ⒊PCR产物呈片状 ⒋出 现非特异扩增; 第二节 PCR类型 一、不对称PCR(asymmetric PCR) 不对称PCR的目的是扩增产生特异长度的单链DNA。PCR反应中采用二种不同浓度的引物，PCR结果产生大量单链DNA。因PCR反应中使用的二种引物浓度不同一步法，因此称不对称PCR，此法产生的单链DNA可用作杂交探针或DNA测序的模板。 进行不对称PCR有二种方法：(1) 一步法;(2) 两步法，第一次PCR用等浓度的引物，以期获得较多的目的DNA片段，取第一次扩增产物(含双链PCR片段)用单引物进行第二次PCR扩增产生单链DNA。 ;二、逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR) RT