分子生物学第五章1.ppt

另一种研究启动子的方法是采用碱基修饰的方法。 可先用碱基修饰试剂对DNA和RNA聚合酶的复合物进行修饰，未与RNA聚合酶结合的DNA，其相应的碱基被修饰。而结合了RNA聚合酶的碱基则不被修饰。 这些分析方法可以确定与RNA聚合酶紧密结合的位点。 有趣的是，在－10区上游的所有紧密结合位点均位于一条DNA链上。这可使RNA聚合酶从DNA的一个侧面接近并识别启动子并与之结合。 One face of the promoter contains the contact points for RNA 二、真核生物的启动子 1. RNA聚合酶Ⅰ启动子的结构 RNA聚合酶Ⅰ的启动子主要由两部分组成的(bipartite)：核心启动子（core promoter）位于－45至＋20的区域内，足以使转录起始。上游调控元件（upstream control element）位于－180至－107，可提高转录起始效率。 2. RNA聚合酶Ⅱ启动子的结构 RNA聚合酶Ⅱ主要负责编码蛋白质和部分核内小rRNA（small nuclear RNA，snRNA）的基因的转录，其启动子结构最为复杂。 RNA聚合酶Ⅱ单独并不能起始转录，必须和其他的辅助因子共同作用形成转录起始复合物才能起始转录。 RNA聚合酶Ⅱ的启动子位于转录起始点的上游，由多个短的序列元件组成，主要有三个保守序列： （1）帽子位点，又称转录起始位点，其碱基大多数为A，这与原核生物相似。 （2）TATA框， 位于－30处，又称Hogness框。一致序列TATAA（T）AA（T）。有些TATA框的突变不影响转录的起始，但可以改变转录起始位点。说明TATA框具有定位转录起始点的功能。 ?’亚基可能与模板结合。 肝素可与?’亚基结合而抑制转录，并且可以和?’亚基竞争DNA的结合位点。 ?亚基和?’亚基提供了RNA聚合酶的活性中心，其一级结构与真核生物RNA聚合酶大亚基有同源性。 ?亚基的功能是帮助全酶识别启动子并与之结合。 ?亚基也可被看作一种辅助因子，因此又可称为?因子（ Sigma factor）。 在转录过程中，RNA聚合酶需要与其他蛋白质辅助因子（转录因子）共同作用，才能保证转录的顺利进行。如转录终止时的终止因子和抗终止因子。 大肠杆菌RNA聚合酶多亚基的复杂结构主要是为酶提供了与多种因子相互作用的能力，从而可以识别多种启动子。 2. ?因子 RNA聚合酶要负责所有基因的转录，也就是说要识别所有转录单位的启动子。因此， ?因子在RNA聚合酶识别启动子的过程中起关键作用。 ?因子的二级结构属于?螺旋，是通过识别启动子上的某一序列来控制RNA聚合酶与启动子的结合的。 A map of the E. coli σ70 factor identifies conserved regions. Regions 2.1 and 2.2 contact core polymerase, 2.3 is required for melting, and 2.4 and 4.2 contact the -10 and -35 promotor elements. The N-terminal region prevents 2.4 and 4.2 from binding to DNA in the absence of core enzyme. E. coli sigma factors recognize promoters with different consensus sequences. (Numbers in the name of a factor indicate its mass) Amino acids in the 2.4 α- helix of σ70 contact specific bases in the non-template strand of the -10 promoter sequence. 目前已发现了至少4种?因子。 在细菌受到外界环境的急剧影响时，会改变所表达的基因，产生?因子更替的现象。如环境温度升高时，大肠杆菌会开启rpoH基因的表达， 其产物?32能识别热激基因的启动子，而正常状态下表达的基因会关闭或表达水平下降。 芽孢菌生活周期过程中生活方式的改变也是通过?因子的更替完成的。 RNA pol 执行多种功能 (1) 识别DNA双链上的启动子； (2) 使DNA变性，在启动子处解旋成单链；及再旋酶活性。 (3) 通过阅读启动子序列，RNA pol确定它自己的转录方向和模板链。 (4) 聚合NTP活性。 (5) 最后当它达到终止子时，通过识别终止子停止转录。 二