植物离体细胞发育的细胞学基础PPT.ppt

（二）KNOX基因在茎尖中的时空表达 1.茎尖分生组织的结构 中央区 (CZ) 周围区 (PZ) 肋区（RZ） 茎端形态发生区 侧生形态发生区 L1 L2 L3 原套 原体 表皮层 皮层原 中柱原 SAM结构 周围区的细胞通常较小,细胞分裂速度较快,位于SAM的侧翼边缘,发育过程中分化为叶、侧芽和茎外层组织。肋区促成茎的伸长。 中心区由分裂慢、体积大的细胞组成,构成了一个自我更新的干细胞库,是形成茎、侧生器官(叶和花)以及叶腋分生组织的细胞源。 以拟南芥为例,拟南芥中有4个KNOX基因: STM,BP,KNAT2和 KNAT6。这些基因共同参与维持茎尖分生组织活力与结构，确 定侧生器官边界等功能。 拟南芥根离体培养过程中和茎（芽）形成相关基因的表达顺序 自体调节/反馈调节 原套 原体 cz PZ RZ STM CUC2 出生侧枝 拟南芥胚胎发育过程中典型基因的表达模式 GA STM (KNOX) CK ARR WUS High CK/Auxin Ratio Low GA AUXIN STM (KNOX) CK CUC Low CK/Auxin Ratio High GA 胚胎发育过程中典型基因的表达模式 §3-6 体细胞胚发生中基因表达与调控 转录水平： mRNA含量 翻译水平： 蛋白质含量 (1)Northern杂交 (2)mRNA差别显示技术 (DDRT-PCR技术) (3) mRNA的体外翻译 (1)蛋白质的双向电泳 (2)Western杂交 (3) ELLSA检测技术(酶联免疫吸附法) ●表达与鉴定: ●调控 1、顺式作用元件及其鉴出:启动子、增强子 2、反式作用因子 转录因子 DNA结合区 转录激活区 螺旋-转角-螺旋结构, 锌指(Zinc finger)结构 亮氨酸拉链(leucine zipper)结构 酸性功能区 谷氨酰胺丰富功能区 脯氨酸丰富功能区 3.体细胞胚发生中基因表达的激素调节； IAA、CTK、ABA、2，4-D 4.蛋白质磷酸化与基因表达 5. DNA的甲基化对基因表达的调控作用 一.体细胞胚发生中特定遗传信息的表达 1.mRNA的合成： ●mRNA在细胞中的含量很低(占总RNA的1%~5%), 每种特异 mRNA的含量则更少。 ●植物细胞中mRNA合成的知识主要来自于对几种能产生高丰 度mRNA的基因的研究。 ● mRNA分子的合成过程大致分为三步： m7G5’ppp5’NPNP 2.胚性蛋白质的形成 ●在有胚胎发生的体细胞培养中均有特异性蛋白表达 ◆苜蓿体细胞胚发生中,在诱导培养第5天的胚性细胞中有50kD的特异性蛋白表达； ◆在胡萝卜、水稻、玉米、豌豆等的胚性愈伤组织中存在45~ 55kD的相关性蛋白； ◆在小麦和枸杞体细胞胚发生早期分别检测到49kD和35 kD相关性蛋白。 二.体细胞胚发生中基因表达常用鉴定方法 1.转录水平上的鉴定 (1) Northern杂交： 通过细胞总RNA或Ploy(A) mRNA与探针的杂交 来分析基因转录水平的方法，称Northern 杂交。 ●程序：植物总RNA的提取；探针的制备；印迹 及杂交。 ●斑点杂交与印迹杂交的区别： 斑点杂交只需要将RNA样品点在固相膜上直接与 探针杂交。此法只能鉴定基因是否转录； 印迹杂交则需要先将提取的总RNA或mRNA样品进 行电泳分离，然后转移到固相膜上，再与探针杂 交。此法可对基因的转录情况进行较详细的分析， 如RNA转录的大小及丰度等。 （2）mRNA差别显示技术 在生物体发育的不同阶段，或是在不同组织或细胞 中发生的不同基因，按时间、空间进行有序的表达方 式，叫基因的差异表达（differential expression）。 ●DDRT-PCR技术的基本原理: 合成两组引物,通过随机组合,使1500种自由mRNA 均有扩增机会,并显示出清晰的电泳条带： DDRT-PCR反应的基本程序 A 从一对不同组织或器官中分离总RNA，分别为A、B两组： B 5’NMAAAAAAAAAAA AA A(A)3n NMTTTTTTTTT TT 3’ 5’ 反转录酶 3’端锚定引物(5’-T11MN-3’) 5’NMAAAAAAAAAAA AA A(A)3