甜杨G6PDH抗冻机制及相关基因克隆.pdf

博士后研究工作报告：甜杨G6PDH抗冻机制及相关摹圉克降(2006) 摘要 甜杨(P．s∞聊蹈邶)是极其抗冻抗旱的高大乔木，其生存区的年平均气温为 oC一．40．5 -3．80C，极端最低气温为46．9oC，冬季气温为-27．4 oC，年平均降雨量为493．4 mm，无霜期仅为93天。因此，甜杨是一种研究木本植物抗冻机制及相关抗冻基因克 隆的理想材料。G6PDH是PPP途径的关键性调控酶，其主要功能是催化葡萄糖-6- 白质、脂肪酸、氨基酸、固醇类等重要物质的生物合成提供各种反应底物和还原力， 同时还涉及到多种环境胁迫而引起的植物应答反应。但至今未见有关木本植物 G6PDH抗冻机制研究以及相关基因的克隆等方面的成功报道。 本研究以甜杨幼苗为试材，以G6PDH活性变化与抗冻性的关系为主线，以细胞 抗冻性和膜稳定性相关的各种生理生化指标的测定为依据，研究了在．200C低温锻炼 糖途径及糖酵解途径的关键性调控酶(G6PDH和和PFK)活性，抗坏血酸．谷胱甘肽 GSH及GSSG含量和蛋白质含量的具体变化，从中探讨G6PDH在低温诱导甜杨幼苗 抗冻性提高的可能作用，进而阐明甜杨抗冻性的可能机制。另一方面，在G6PDH分 离纯化的前提下，研究了还原型二硫苏糖醇(DTl-耐)，pH值、代谢物及金属离子对 G6PDH活性的影响，并对该酶催化反应特性进行分析。在此基础上，根据已有的拟 thaliana)和马铃薯(Solanum 南芥(Arabidopsis 的基因等克隆技术分离并确定与抗冻性相关的G6PDH基因，并对其核苷酸序列及其 推导的氨基酸序列进行同源性分析。通过上述研究可得到以下主要结果： 1．以甜杨G6PDH活性变化与抗冻性的关系为主线，以细胞抗冻性和膜稳定性相 关的各种生理生化指标的测定为依据，对在-200C低温锻炼及脱锻炼过程中幼苗体内 径的关键性调控酶(G6PDH和和PFK)活性，抗坏血酸．谷胱甘肽循环的关键性调控 含量和蛋白质含量的动态变化进行了系统研究，并对上述各理化指标间的内在联系， 以及它们与G6PDH活性变化及抗冻性的相关性进行分析，这在国内外上尚未报道。 博士后研究工作报告：甜杨G6PDH抗冻机制及相关摹困克隆(2006) 实验结果表明，低温锻炼所引起的抗氧化酶(SOD，POD和CAT)活性、抗坏血酸． 且这些指标的变化与幼苗MDA含量、H202含量以及半致死温度u钿的降低密切相 关。由此可认为G6PDH可能参与了甜杨幼苗抗氧化酶活性及抗坏血酸．谷胱甘肽循环 运转能力的调节、抗氧化剂和膜结构稳定性相关物质的合成以及抗冻性的低温诱导， 是甜杨抵御冰冻低温的一种重要生理物质。 2．为了探讨低温锻炼对不同糖代谢途径的影响效应，对在低温锻炼和脱锻炼中 在．20oc低温锻炼中，幼苗枝条内的NADH含量的增加幅度以及PFK活性的提高程 度分别不如NADPH含量和G6PDH活性明显，但脱锻炼所引起的下降程度却分别比 NADPH含量和G6PDH活性显著。这说明低温锻炼对酵解途径的影响效应相对较小， 反映出不同糖代谢途径对低温胁迫应答具有一定的差异。据此可认为，低温锻炼可能 引起了体内糖代谢途径的改变与能量的适应性变化，而甜杨幼苗在低温下可能主要是 通过PPP途径来产生高水平的NADPH，才能满足与抗冻性发育有关的RNA、蛋白 质等生物合成的需要。 3．细胞抗氧化能力与抗冻性关系的研究结果表明，低温锻炼所引起的SOD、POD 和GSSG含量仍高于未锻炼幼苗水平。由此可见，不同抗氧化酶在细胞内清除H202 的过程中所起的作用存在着一定的差异，在低温胁迫下甜杨幼苗内H202的清除主要 是通过抗坏血酸．谷胱甘肽循环来实现的。这也在一定程度上反映出低温锻炼的幼苗 在脱锻炼后还能保持较高的抗坏血酸．谷胱甘肽循环能力和清除H202能力，可能与维 持脱锻炼后幼苗恢复正常生长的需要有关。 4．首次以从-20 oC低温锻炼的甜杨幼苗中分离纯化的G6PDH为研究对象，研究 了还原型二硫苏糖醇(Drr删)、pH值、代谢物及金属离子对G6PDH活性的影响， 并对该酶催化反应特性进行分析。结果发现，所分离纯化的G6PDH定位于细胞质、 CoA、Acetyl 活性有较强的抑制作用。另外，该酶的最大反应速度为68U／mgprotein，底物G6P