莱氏衣原体膜上ATPase的热变性行为—差示扫描量热法及热凝胶分析.pdfVIP

维普资讯 科 学 通 报 第 38卷 第 2期 CHINESE SCIENCE BULLETIN l993年 1月 莱氏衣原体膜上 ATPase的热变性行为 l6z一 — — 差示扫描量热法及热凝胶分析 ， 直监 避 黄 芬 C中国科学院生物物理研究所，北京 100iO1) 关键词 ． 薹垦壅璺壁M。 “。、苎垦壁竺 、竺! 莱 氏衣原体作为一类缺少细胞壁的简单的原核生物，常被用来作为生物噗研究的模型 ． 菜 氏衣原体膜的差示扫描量热 (differentialscanninffcMorimetry，DSC)曲线 ，是确认生 物膜存在由晶态转变为液晶态的一个有力的证据∞． 但对菜氏衣原体囔精细 DSC 图谱 尚无 人进行研究．近几年来高灵敏度的差示扫描量热仪法的出现，为研究生物膜的结构和功能提 供了—个有力的工具，它能清晰地显示膜上主要蛋 白的热转变峰，用这种方法得到了许多天 然膜结构的精细 DSC 图谱 ．我们在过去对菜氏衣原体膜上 ATPase研究的基础上 “】，利用 高灵敏度的差示扫描量热仪，结台热凝腔分析法 (thermalgelaa~[ysi．s，TGA)，研究了莱 氏衣原体膜 ATPase变性行为 ，确定了莱氏衣原体膜 DSC 曲线上的C峰主要是 田 ATPase 舶热变性所 引起，并用 ATPase变性的方法加 以证实． 1 材科 和 方 法 Ll 材料 ’ 莱氏衣原体 AIHO89菌株系 由江苏省农业科学院畜牧兽医研究所赠予．细胞的生长、收 集、溶菌和膜的分离制备参照文献 [31．其它试剂均为分析纯． 1．2 差示扫描量热法测定 莱氏衣原体膜悬浮在 1：20p-缓冲液 (0．15mol／LNaC1，O．05otol／LTris，001mol／L 一 巯基乙醇 ，pH74)，膜蛋白浓度 4mg／m1． DSC 热曲线测定在 MC-2差示扫描量 热 仪 (MicrocalInc．Amherst，MA，USA)上进行，样品池体积 L208ml，扫描速 率 0-5~C／rain． 样品经加热后扫描得到变性后的 DSC 曲线． 1．3 梯度凝胶电泳 莱 氏衣原体膜 (蛋 白浓度 2mg／m1)在所需的温度下变性 10rain后 ，加入终浓度分别为 2％ TrltonX一100，0．1瞄脱氧胆酸钠 (DOC)及 10％的甘油 ，、37~C温育 I5rain后 ，用于梯度 凝瞳电泳．凝胶梯度为 3—8％，电泳缓冲液为 Tr{s—HCI(pH8．0)含 0．1~TritonX-100，电 泳 电压 10OV，电泳时间 5h． 19920‘5—28收稿，1902-08—28收悠改蔼 ·胃家 自然科学基金资助项耳． 维普资讯 第 2期 科 学 通 报 凝胶电泳后用0．25予刍考马斯亮蓝 R-250染色，脱色后用双波长薄层扫描仪 (岛津 cs，· 9l0)于 590nm 波长处扫描．ATPase的活性染色按 Chen等 的方法进行． 1．4 ATPase 的热变性 曲线 将莱 氏衣原体嗅悬浮液 (蛋白浓度 Zmg／m1)在水浴中升温 (升温速度近似 0．5~C／min)， 在不同的温度下取出50 l测定 ATPase 活性，ATPase活性的测定按 Jinks等方法进 行 ． 2 结 果 和 讨 论 采用差示扫描量热法测定天然膜中某个组分结构变化 比较困难，Brandts等人