蛋白酶体抑制剂对小鼠孤雌激活胚胎的影响.docVIP

精品论文 参考文献 蛋白酶体抑制剂对小鼠孤雌激活胚胎的影响 丁晨晖 （中山大学附属第一医院生殖医学中心 广东广州 510080） 【摘要】 MG132是一种蛋白酶体抑制剂，它可以提高大鼠和小鼠克隆胚胎的体外发育能力，但是人们对于MG132对于卵母细胞产生影响的作用机制仍然不是很清楚。本研究检测了MG132处理之后小鼠孤雌激活胚胎的成熟促进因子（MPF）活性的变化、以及原核形成和第一次卵裂时间，我们推测MG132可能是通过保持小鼠卵母细胞内MPF的活性延迟了卵母细胞老化的过程，从而提高了克隆胚胎的体内外发育能力。 【关键词】 MG132 孤雌激活 成熟促进因子 【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2012）20-0385-02 前言 尽管已经有十余种哺乳动物被成功的克隆，但是体细胞克隆的效率仍然很低（1－3％）。为了提高克隆的效率，人们做了很多尝试。研究表明，通过蛋白酶体抑制剂MG132处理可以显著提高小鼠和大鼠克隆胚胎体内外的发育能力[1,2]，但是MG132卵母细胞作用的机理仍然不是特别清楚。 以往的实验结果表明，MG132可以通过抑制MPF亚基的水解防止MPF浓度的下降，但是人们仍然不清楚是否可以保持MPF的活性。对于MPF来说，组蛋白H1是一个非常经典的底物，通过对H1磷酸化的检测可以间接对MPF的活性进行测定。本研究发现，MG132处理之后的卵母细胞在激活30分钟之后仍然保持了很高的活性，此外小鼠孤雌激活胚胎的原核形成和第一次卵裂的时间都被推迟了1-2小时。这说明MG132可能是通过保持MPF的活性来防止卵母细胞老化的。 材料方法 1. 收集卵母细胞和颗粒细胞 8－10周龄雌性B6D2F1小鼠注射10IU 孕马血清（PMSG），48小时后注射10IU 人绒毛膜促性腺激素（hCG）。注射hCG14小时后取卵，用0.1% (w/v)透明质酸酶（300U/mg）去除卵母细胞周围的颗粒细胞，在37℃，5% CO2的培养箱中培养。 2、MPF活性检测 通过组蛋白H1的磷酸化来检测MPF的活性[3]。将小鼠卵母细胞在含10mu;M MG132的KSOM培养基中处理3小时，用无Ca2+的CZB激活液（含10mM Sr2+ 和 5mu;g/ml CB）处理30分钟后，取出卵母细胞做MPF活性检测。每组样品取10个卵母细胞，未处理的孤雌激活胚胎作为对照。同时，将激活液处理5小时的孤雌激活胚胎培养在KSOM培养基中，每隔两小时观察原核形成和第一次卵裂的情况。 结果 1、MPF活性检测 通过检测组蛋白H1磷酸化的水平来测定MPF的活性。结果显示，用MG132处理3小时之后的卵母细胞中MPF的活性高于对照组中（图1，A），而在激活30分钟之后，对照组中MPF的活性已经基本上降到一个很低的水平，而处理组中MPF的活性仍然保持了很高的水平（图1，B）。 2、MG132对孤雌激活胚胎原核形成和第一次卵裂的影响 通过对孤雌激活胚胎在激活后4－22小时中每隔两个小时检测一次原核形成情况。结果显示，处理组比对照组在原核形成以及第一次卵裂时间上推迟了1－2小时。在激活后4h时对照组孤雌激活胚胎开始大量出现可见的原核（20/44, 45％），而处理组只有少数观察到原核出现（3/41, 7％）。当激活后16h时，对照组只有2％(1/44)还存在原核，而处理组100％可以观察到清晰的原核。同样对照组的第一次卵裂发生在激活后18h时（34/44, 77％的二细胞），而对照组中大多数胚胎第一次卵裂是在激活后20小时（32/41, 78％）。 讨论 卵母细胞的质量对于胚胎的后期发育有着重要的影响。随着卵母细胞在体外时间的延长，卵母细胞发生明显老化，对后期胚胎发育的支持能力逐步降低。卵母细胞老化的标志之一就是MPF活性逐渐降低。同时，在卵母细胞向合子期转变的过程中，MPF活性降低是一个必然的过程。MPF主要由两个部分组成，一个是P34cdc2，另一个是cyclin B，通过cyclin B的生成和降解调节MPF的活性。对于MPF来说，组蛋白H1是一个非常经典的底物，通过对H1磷酸化的检测可以间接的对MPF的活性进行测定。通过检测MPF的活性我们发现，在激活后30分钟的时候，对照组卵母细胞中的MPF活性已经降低很多，而处理组中仍然保持了一个很高的MPF活性水平。由于MG132 处理之