实验8 酵母RNA的提取----苯酚法-20090301.pptVIP

实验八 酵母RNA的提取——苯酚法 * * 一、实验目的和要求 1、 了解核酸的组成及RNA提取技术。 2、 掌握用苯酚法制备RNA的原理和方法 二、实验基本原理 苯酚法适用于tRNA的提取。从细菌或酵母细胞中提取tRNA，可在不经细胞破碎，直接用被水饱和的中性苯酚抽提，苯酚可以改变细胞壁的通透性，使tRNA (分子量在25000左右)从细胞中释入出来，而大分子核酸仍留在细胞内。通过离心，将含有酚水和细胞碎片的乳浊液分成两相， 上层水相为水溶性RNA、多糖及小分子极性物质，下层酚相为被水饱和的酚、变性蛋白质和DNA（大多与变性蛋白质缠连）菌体残渣等。在酚相和水相界面有一层凝集的变性蛋白质。用乙醇沉淀水相中的大分子物质，tRNA即呈白色絮状沉淀析出，同时除去可溶性的酯类等杂质。再离心，弃上清液，得到tRNA沉淀样品。苯酚法是提取具有生物活性的，不降解RNA的简便而有效的方法。 酵母RNA的提取→乙醇沉淀 →得到粗品RNA 三、实验材料与试剂 1、实验材料 市售干酵母粉 2、实验试剂 ⑴ 90%苯酚水溶液 (含0.1% 8-羟喹啉) ⑵ 95%乙醇 四、实验器材与仪器 1、 离心机、离心管（7ml） 2、 制冰机 3、 分析天平 4、 托盘天平（平衡离心管） 5、 摇床 6、 具塞锥形瓶 (150ml) 7、 量筒(10ml)、烧杯、滴管和小玻棒 五、实验操作方法和步骤 1、酵母细胞破碎、提取RNA ： 称取干酵母粉1.0g , 入150 ml具塞锥形瓶中，加蒸馏水5ml , 再小心加入90%苯酚5ml（苯酚有毒！并具腐蚀性），盖好锥形瓶的塞子，在摇床上振摇反应 40 min后，把具塞锥形瓶中的内容物转入2支7ml离心管中,将2支离心管平衡后，8000rpm离心10min。用吸管小心吸取上清液（含RNA)转移到另一支干净离心管中。见图1。 图1. 苯酚提取液离心后分层的情况 水层（RNA、多糖） 中层（变性蛋白层） 3. 酚层（DNA及蛋白质） 1 2 3 2、有机溶剂（乙醇）纯化RNA： 含有RNA溶液中加入2倍体积的95%乙醇，混匀，于冰浴中放置20 min，RNA结絮沉淀出来。5000rpm 离心5min。小心弃去上清液，用小玻棒将沉淀小心转移到称量纸上，自然风干或烘干。RNA粗制品供定量实验用。 六、注意事项 1、离心前样品离心管一定要先平衡，并对称放入离心机中。 2、吸取上清液时，不能搅动界面，更不能吸入界面物质。 3、苯酚不要弄到手上、皮肤上或桌上，以免损伤皮肤和衣物。