甲醛高效降解菌.pptVIP

二.甲醛降解菌w的复筛 三.甲醛降解菌w的形态学观察及其生理生化鉴定 甲醛降解菌的菌落形态学观察 2 芽孢染色 3.电镜试验 4.糖发酵试验 5.甲基红，吲哚，v.p试验 四.甲醛降解菌w的DNA提取及其琼脂糖凝胶电泳  五.降解特性的研究 * * * * 甲醛高效降解菌的筛选鉴定及其降解特性的研究 安徽工程大学 李刚 甲醛降解菌的初步筛选 甲醛降解菌w的形态学观察及其生理生化鉴定 甲醛降解菌w的DNA提取及其琼脂糖凝胶电泳 ↓ 实验步骤框架 降解特性的研究 甲醛降解菌w的复筛 ↓ ↓ ↓ 一.甲醛降解菌的初步筛选 1.土样的采集 2.土壤稀释液的制备 3.微生物增殖及其富集分离培养基的制备 4 接种及富集培养 5.富集液稀释分离及初步筛选 经初步筛选获得一株长势良好的菌株（在1000ul/L条件下长势最佳），并将其命名为w，在无菌操作下，用划线的方法接种到甲醛含量为1000ul/L的LB平板上。将其放在30°C恒温培养箱中培养48小时后，即可得到经过纯化后的菌落。制作试管斜面保存。 通过3种浓度梯度的甲醛富集培养基的筛选，只有稀释10倍平板上长出菌体，观察其菌落可以发现三个培养基中的菌落形态相同，可以确定为同一种菌株。 1500ul/L甲醛平板上长出的单菌落 500ul/L甲醛平板上长出的单菌落 1000ul/L甲醛平板上长出的单菌落 1 革兰氏染色 16x100倍 革兰氏染色 （菌株w为阴性） 16x100倍 芽孢染色（菌株w不产芽孢） 电镜试验结果（菌株w为杆状） 刚接种菌株w时所拍的糖酵解试验照片 48小时后菌株w糖酵解试验照片 （从左到右依次为乳糖发酵试管2支、葡萄糖发酵试管2支、蔗糖发酵试管2支，乳糖对照试管1支，葡萄糖对照试管1支，蔗糖对照试管1支） 甲基红试验（菌株w反应为阳性） 吲哚试验（菌株w反应呈阴性） v.p（菌株w反应呈阳性） 1.DNA提取的步骤 1.取培养好的液体培养基1.5ml，12000rpm离心2min，弃上清。 2.向沉淀物中加入500ul的TE缓冲液，吹打重悬，后加入30ul的10%SDS和10ul 20mg/ml的蛋白酶K，混匀，置于37°C恒温一小时。 3.加100ul 5mol/LNacl，混匀，再加80ul（CTAB/Nacl）于65°C水浴10min。 4.将2.5ml的离心管加满氯仿/异戊醇，1200rpm离心4-5min，后将上清液转入新的离心管中。 5.将新的离心管加满冰乙醇，4°C冰箱保存40min后，离心5min，弃上清，干燥沉淀，将其融入适量的灭菌水中。 2. 甲醛降解菌菌株w DNA扩增 提取菌株总DNA并进行16SrDNA基因扩增，该菌16SrDNA基因的通用引物P1：5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和P2：5’-GGYTACCTTGTTACGACTT-3’，由上海生工生物公司合成。 PCR产物的电泳检测： 取扩增产物5μL与5μL的10×DNA Loading Buffer 充分混合后，点样于1%琼脂糖凝胶上（含1.5μL EB），在1×TAE缓冲液中电泳，恒流64mA电泳60min。电泳完毕后取出凝胶放入紫外透射仪下观察电泳结果，并用数码相机拍照。 3.DNA质量的检测 PCR扩增产物1%琼脂糖凝胶电泳 菌株w基因组DNA1%琼脂糖凝胶电泳 通过与参考文献比对，结合生理生化试验和形态学观察通过伯杰氏手册可以初步鉴定为臭恶假单胞菌杆菌。 1.甲醛浓度对降解率的影响 2.pH对降解率的影响 3.接种量对降解率的影响 4.摇床转速对降解率的影响 *