第五章 1PCR.pptVIP

1）TaqMan荧光探针 TaqMan荧光探针原理 用荧光基团标记PCR特异性荧光探针，探针5端标记一个报告荧光基团，3端标记一个淬灭荧光基团。 探针完整时报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收---检测不到荧光信号； PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针 酶切降解，报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，荧光监测系统接收到荧光信号 每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，使荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步 根据反应液的荧光强度计算出初始模板的量 TaqMan 荧光探针工作原理 缺点 采用荧光淬灭及双末端标记技术，因此淬灭难以彻底，本底值较高； 采用酶外切活性，因此定量时受酶性能影响； 探针标记成本较高，不便普及应用。 2）Molecular beacon 分子信标探针：在探针的两末端分别标记荧光基团和淬灭基团，与TaqMan探针不同的是，该探针5’和3’末端自身可形成8个碱基左右的发卡结构（FRET），此时荧光分子和淬灭分子邻近，因此不会产生荧光。当溶液中有特异模板时，该探针与模板杂交，从而破坏了探针的发卡结构，溶液便产生荧光，荧光的强度与溶液中探针的量成正比，因此可用于PCR定量分析。分子信标技术结合不同荧光标记可用于基因多突变位点同时分析 3）Lightcycler Roche公司开发的一种PCR定量技术 该技术的特点也是将荧光分子和淬灭分子分别标记在